Faltungskatalyse durch Prolylisomerasen:
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1999
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I
NHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
DIE
ANFAENGE
.
1
1.2
DAS
FALTUNGSPROBLEM
.
1
1.3
MOLEKULARE
CHAPERONE
.
3
1.4
FALTUNGSKATALYSATOREN
.
5
1.4.1
PROTEIN-DISULFID-ISOMERASEN
.
5
1.4.2
PEPTIDYLPROLYL-CW-TRANS-ISOMERASEN
.
5
1.5
RNASE
TI
ALS
MODELLSYSTEM
FIIR
DIE
PROTEINFALTUNG
.
14
1.6
PROBLEMSTELLUNG
.
17
2
MATERIALIEN
UND
METHODEN.
--------------
.
-----
.19
2.1
MATERIALIEN
.
19
2.2
GEWINNUNG
VON
(S54G/P55N)RNASE
TI
AUS
E.
COLI
DH5A
.
20
2.3
GEWINNUNG
DES
TRIGGER-FAKTORS
AUS
E.
COLI
ML
5
.
20
2.4
GEWINNUNG
VON
CPR3
UND
SLYD
AUS
E.
COLI
-TOP10
.
20
2.4.1
COEXPRESSION
VON
DNAY
ZUR
ERHOEHUNG
DER
AUSBEUTE
.
21
2.4.2
ANZUCHT
VON
CPR3-UEBERPRODUZENTEN
.
22
2.4.3
IMAC:
METALLCHELATCHROMATOGRAPHIE
AN
NI-NTA
.
23
2.4.4
ANIONENTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE
AN
TMAE-FRACTOGEL
EMD-650
M
.
23
2.4.5
GELFILTRATION
UEBER
SUPERDEX
75*HILOAD
.
23
2.4.6
ENTEROKINASESPALTUNG
DER
N-TERMINALEN
FUSION
.
24
2.5
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINEN
.
24
2.6
FLUORESZENZSPEKTREN
.
24
2.7
CIRCULARDICHROISMUS-SPEKTREN
.
24
2.8
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
GUHCL,
HARNSTOFF
UND
NACL
.
25
2.9
PROTEASEGEKOPPELTER
PROLYLISOMERASETEST
.
25
2.10
PROTEASEFREIER
PEPTIDTEST
.
27
2.11
MESSUNG
UND
AUSWERTUNG
KONFORMATIONELLER
UEBERGAENGE
.
28
2.12
FKBP12
.
29
2.12.1
HAMSTOFFINDUZIERTER
ENTFALTUNGSUEBERGANG
.
29
2.12.2
FALTUNG
UND
ENTFALTUNG
VON
FKBP12
.
29
2.12.3
REAKTIVIERUNG
VON
FKBP
12
.
29
2.13
PARVULIN
.
30
2.13.1
HAMSTOFFINDUZIERTER
ENTFALTUNGSUEBERGANG
.
30
2.13.2
KINETISCHE
EXPERIMENTE
ZU
FALTUNG
UND
ENTFALTUNG
VON
PARVULIN
.
30
2.13.3
REAKTIVIERUNGSKINETIK
VON
PARVULIN
.
30
2.13.4
DOPPELSPRUNGVERSUCH
MIT
PARVULIN:
RUECKFALTUNG
AUSGEHEND
VON
UF
.
31
2.14
REDUKTION
UND
CARBOXYMETHYLIERUNG
VON
(S54G/P55N)-RNASE
TI
.
31
2.15
FALTUNGSEXPERIMENTE
MIT
RCM-TL
.
31
2.15.1
MICHAELIS-MENTEN-KINETIKEN
VERSCHIEDENER
PROLYLISOMERASEN.
32
2.15.2
BESTIMMUNG
DER
MIKROSKOPISCHEN
GESCHWINDIGKEITSKONSTANTEN
VON
RCM-
(S54G/P55N)-RNASE
TI
IM
UEBERGANGSBEREICH.
33
2.15.3
DOPPELSPRUNGEXPERIMENTE
MIT
RCM-TL:
EINFLUSS
DES
TRIGGER-FAKTORS
AUF
DIE
FALTUNGSREAKTION
AUSGEHEND
VON
UF
.
34
2.15.4
INHIBITION
VON
PROLYLISOMERASEN:
DIE
AUSWERTUNG
VON
BINDUNGSDATEN
.
35
2.15.5
INHIBITION
VON
PROLYLISOMERASEN
IM
RCM-TL-FALTUNGSTEST
.
36
2.16
BESTIMMUNG
DER
AFFINITAET
VON
CPR3
ZU
CYCLOSPORIN
A
.
37
N
INHALTSVERZEICHNIS
2.16.1
FLUORESZENZTITRATION:
KO-BESTIMMUNG.
37
2.16.2
INHIBITION
IM
PEPTIDTEST:
K-BESTIMMUNG
.
37
2.17
CHAPERONEIGENSCHAFTEN
VON
PROLYLISOMERASEN.
38
2.17.1
CITRATSYNTHASE
(CS)
.
38
2.17.2
A-GLUCOSIDASE:
AGGREGATIONS
UND
AKTIVITAETSTEST
.
38
2.17.3
CARBOANHYDRASE.
39
3
ERGEBNISSE
&
DISKUSSION
.41
3.1
FKBP12:
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FALTUNG
EINES
FALTUNGSHELFERS.41
3.1.1
DIE
RUECKFALTUNG
VON
FKBP12
IST
PROLINLIMITIERT
.
41
3.1.2
DIE
FALTUNG
VON
FKBP12
IST
KONZENTRATIONSABHAENGIG
.
43
3.1.3
EINE
N-TERMINALE
FUSION
VERMINDERT
DIE
KONFORMATIONELLE
STABILITAET
VON
FKBP
12.
.45
3.1.4
DIE
KONZENTRATIONSABHAENGIGKEIT
DER
FALTUNGSGESCHWINDIGKEIT
VON
EK-FKBP12
IST
SEHR
AUSGEPRAEGT
.
46
3.1.5
FLUORESZENZLOESCHUNG
UND
REAKTIVIERUNG
VERLAUFEN
PARALLEL
.
48
3.1.6
FK506
VERLANGSAMT
DIE
FALTUNG
VON
FKBP12
.
49
3.2
PARVULIN:
ENZYMEIGENSCHAFTEN
EINER
NEUARTIGEN
PROLYLISOMERASE.51
3.2.1
DIE
THERMODYNAMISCHE
STABILITAET
VON
PARVULIN
.
52
3.2.2
FALTUNG
UND
ENTFALTUNG
UNTER
IDENTISCHEN
BEDINGUNGEN:
DIE
ENTFALTUNG
VON
PARVULIN
IST
REVERSIBEL
.
54
3.2.3
DOPPELSPRUNGVERSUCHE
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
PROLINLIMITIERTER
SCHRITTE
IN
DER
FALTUNG
VON
PARVULIN
.
56
3.2.4
DIE
FALTUNG
VON
PARVULIN
IST
EINE
AUTOKATALYTISCHE
REAKTION
.
57
3.2.5
IN
VITRO-SPIELEREI
VERSUS
PHYSIOLOGISCHE
RELEVANZ
.
60
3.3
PARVULIN
UND
RHFKBP12
ALS
FALTUNGSKATALYSATOREN
.
60
3.4
DER
TRIGGER-FAKTOR.
.
M
YY.
M
.
M
.YY.YY63
3.4.1
EIN
BEMERKENSWERTER
FALTUNGSHELFER.
63
3.4.2
DER
TRIGGER-FAKTOR
ALS
MICHAELIS-MENTEN-ENZYM
.
64
3.4.3
DIE
MIKROSKOPISCHE
REVERSIBILITAET
DER
ISOMERISIERUNGSKATALYSE
IN
RCM-TL
.
66
3.4.4
ENTFALTUNG
VON
RCM-TL
:
DER
EINFLUSS
DES
TRIGGER-FAKTORS
AUF
DIE
MIKROSKOPISCHEN
GESCHWINDIGKEITSKONSTANTEN.
68
3.4.5
DER
EINFLUSS
DES
TRIGGER-FAKTORS
AUF
DIE
DIREKTE
FALTUNG
VON
UF
.
69
3.4.6
DER
TRIGGER-FAKTOR
IM
PEPTIDTEST
.
71
3.4.7
DER
TRIGGER-FAKTOR
BINDET
ENTFALTETE
POLYPEPTIDKETTEN
.
73
3.4.8
HINWEISE
AUF
EINE
SUBSTRATBINDUNGSSTELLE
AUSSERHALB
DES
AKTIVEN
ZENTRUMS
.
76
3.4.9
DIE
PROTEASEEMPFINDLICHKEIT
DES
TRIGGER-FAKTORS
.
78
3.4.10 DIE
HOHEN
STERISCHEN
ANSPRUECHE
DES
TRIGGER-FAKTORS.
81
3.4.11
DER
TRIGGER-FAKTOR
KANN
FALTUNGSREAKTIONEN
VERLANGSAMEN
.
83
3.4.12
DER
TRIGGER-FAKTOR
BESITZT
EIGENSCHAFTEN
EINES
YYKLASSISCHEN
"
MOLEKULAREN
CHAPERONS
.
85
3.4.13
DIE
ROLLE
VON
PROLINEN
BEI
DER
SUBSTRATERKENNUNG
DURCH
DEN
TRIGGER-FAKTOR
.
87
3.4.14
DIE
KOMPLEXE
AUS
TRIGGER-FAKTOR
UND
BINDUNGSSUBSTRATEN
SIND
DYNAMISCH
.
91
3.4.15
DER
EINFLUSS
NEGATIVER
LADUNGEN
AUF
DIE
BINDUNGSEFFIZIENZ
.
93
3.4.16
INHIBITION
DES
TRIGGER-FAKTORS
DURCH
CHYMOTRYPTISCHE
RCM-LA-FRAGMENTE
.
95
3.4.17
INHIBITION
DES
TRIGGER-FAKTORS
DURCH
TRYPTISCHE
FRAGMENTE
VON
RCM
(P39A)-T1.
.97
3.4.18
INHIBITION
DES
TRIGGER-FAKTORS
DURCH
SYNTHETISCHE
TETRAPEPTIDE
.
99
3.4.19
DER
TRIGGER-FAKTOR
BINDET
VORZUGSWEISE
LANGE
SUBSTRATKETTEN.
101
3.4.20
IST
DER
TRIGGER-FAKTOR
EIN
FK506-BINDENDES
PROTEIN?
.
102
3.5
MITOCHONDRIALES
CYCLOPHILIN
AUS
CEREVISIAE.-.105
3.5.1
DIE VORGESCHICHTE
.
105
3.5.2
MUTATIONEN
IM
AKTIVEN
ZENTRUM
VON
CPR3
UEBEN
SCHEINBAR
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
INHALTSVERZEICHNIS
M
FALTUNGSAKTIVITAET
IN
VITRO
AUS
.
106
3.5.3
CPR3
IM
PEPTIDTEST:
EIN
YYGANZ
GEWOEHNLICHES
CYCLOPHILIN
"
.
109
3.5.4
CPR3
BINDET
CYCLOSPORIN
A
MIT
HOHER
AFFINITAET
.
111
3.5.5
CPR3
IM
FALTUNGSTEST:
EIN
UNAUFFAELLIGER
FALTUNGSHELFER
.
114
3.5.6
ARGININ
73
UND
HISTIDIN
144
SIND
RESTE
DES
AKTIVEN
ZENTRUMS
VON
CPR3
.
115
3.6
EIN
NEBENPRODUKT
DER
CPR3-GEWINNUNG
AUS
E.
COLI:
SLYD.
.119
3.6.1
ZUR
ENTDECKUNG
VON
SLYD
.
119
3.6.2
SLYD
IST
EIN
AUSGEZEICHNETER
FALTUNGSKATALYSATOR.
120
3.6.3
SLYD
IST SEHR
PROTEASESENSITIV
.
121
3.6.4
SLYD
BINDET
ENTFALTETE
PROTEINKETTEN
MIT
HOHER
AFFINITAET
.
123
3.6.5
DIE
INHIBITION
VON
SLYD
DURCH
NI
2+
UND
FK506
.
124
4
ZUSAMMENFASSENDE
DISKUSSION.
.127
4.1
DER
TRIGGER-FAKTOR
ALS
MOEGLICHER
RIBOSOMALER
FALTUNGSHELFER
.
127
4.2
VORZUEGE
UND
GRENZEN
DES
MODELLSYSTEMS
RNASE
TI
.
130
4.3
ZUR
ALLGEMEINEN
BEDEUTUNG
VON
PROLYLISOMERASEN
.
131
4.4
EPILOG:
ZUR
AUSSAGEKRAFT
VON
IN
VIFRO-EXPERIMENTEN
.
132
5.
ZUSAMMENFASSUNG._.135
6
SUMMARY
_
.
--------
.
-
.
------
.
-----
.
_138
EIGENE
PUBLIKATIONEN
.
140
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
141
DANKSAGUNG
.
143
QUELLENVERZEICHNIS
.
144 |
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