Entwicklung und Anwendung von in-situ-Hybridisierungsmethoden für Cyanobakterien:
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| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
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Konstanz
Hartung-Gorre
1999
|
| Edition: | 1. Aufl. |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
2
MATERIAL
UND
METHODEN
9
2.1
VERWENDETE
ORGANISMEN
9
2.1.1
CYANOBAKTERIEN
9
2.1.2
ANDERE
ORGANISMEN
10
2.1.3
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
10
2
J
FIXIERUNG
VON
ZELLEN
10
2.2.1
FIXIERUNG
MIT
ETHANOL
11
2.2.2
FIXIERUNG
MIT
PARAFORMALDEHYD
11
23
EXTRAKTION
VON
NUKLEINSAEUREN
FUER
ANSCHLIESSENDE
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
NACH
DER
YYFREEZE-THAW
"
-METHODE
12
2.4
AMPLIFIZIERUNG
VON
RIBOSOMALEN
RNS-GENEN
(RDNS)
12
2.4.1
PCR-REAKTION
13
2.4.2
ANALYSE
DER
AMPLIFIKATE
15
2.4.3
AUFREINIGUNG
DER
PCR-AMPLIFIKATE
17
23
NICHTRADIOAKTIVE
SEQUENZANALYSE
VON
DNS-MOLEKUELEN NACH
DEM
YYCYCLE
SEQUENCING
"
-
PROTOKOLL
17
2.6
AUSWERTUNG
DER
SEQUENZDATEN
UND
KONSTRUKTION
VON SONDEN
18
2.6.1
VERGLEICHENDE
ANORDNUNG
DER
SEQUENZEN
(ALIGNMENT)
18
2.6.2
REKONSTRUKTION
VON
STAMMBAEUMEN
19
2.6.3
KONSTRUKTION
VON
GEGEN
1
6S
RRNS
GERICHTETEN
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
19
2.7
MEERRETTICHPEROXIDASE-MARKIERUNG
VON
OLIGONULDEOTIDEN
20
2.7.1
AKTIVIERUNG
DES
OLIGONUKLEOTIDS
UND
KOPPLUNG
DER
MEERRETTICHPEROXIDASE
(POD)
20
2.7.2
AUFREINIGUNG
21
2.7.3
AUFKONZENTRIERUNG
UND
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
22
2.8
FLUORESZENZ-MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
24
2.8.1
MARKIERUNGSREAKTION
24
2.8.2
ABTRENNUNG
DES
NICHT
UMGESETZTEN
FARBSTOFFES
25
2.8.3
ABTRENNUNG
DES
UNMARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDANTEILS
25
2.8.4
ABTRENNUNG
VON
SALZEN
26
2.8.5
PHOTOMETRISCHE
VERMESSUNG
DER
MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDE
27
2.9
HYBRIDISIERUNG
MIT
MEERRETTICHPEROXIDASE-MARKIERTEN
OIIGONUKIEOTIDEN
27
2.9.1
MEMBRANHYBRIDISIERUNGEN
29
2.9.2
GANZZELLHYBRIDISIERUNG
31
2.9.3
NICHTFLUORESZIERENDER
NACHWEIS
DER
MEERRETTICHPEROXIDASE-MARKIERTEN
SONDEN
32
2.9.3.1
4-TRIETHYLENTRIOXY-L-NAPHTHOL
32
2.9.3.2
DAB-SUBSTRAT
33
2.9.4
CHEMILUMINESZENZNACHWEIS
33
2.9.5
TYRAMID-SIGNAL-AMPLIFIKATION
(TSA)
ALS
FLUORESZIERENDER
NACHWEIS
POD-MARKIERTER
SONDEN
33
2.9.6
VORBEHANDLUNGEN
35
2.10
DOPPELHYBRIDISIERUNGEN
MIT
MEERRETTICHPEROXIDASE-MARKIERTEN
SONDEN
37
2.11
GANZZELLHYBRIDISIERUNGEN
MIT
FLUORESZENZMARKIERTEN
OIIGONUKIEOTIDEN
37
2.12
DOKUMENTATION
DER
HYBRIDISIERUNGSERGEBNISSE
39
2.12.1
KONVENTIONELLE
LICHT-BZW.
AUFLICHTFLUORESZENZMIKROSKOPIE
-
39
2.12.2
KONFOKALE
LASERSCANNING-MIKROSKOPIE
40
2.13
QUANTIFIZIERUNG
VON
FIUORESZENZSIGNALEN
41
2.13.1
QUANTIFIZIERUNG
MITTELS
MIKROSKOPGESTUETZTER
BILDVERARBEITUNG
41
2.13.1.1
VOREINSTELLUNG
DER
PARAMETER
ZUR
BILDAUFITAHME
41
2.13.1.2
AUFNAHME
DER
BILDER
42
2.13.1.3
AUSWERTEN
DER
BILDER
42
2.13.2
QUANTIFIZIERUNG
MITTELS
DURCHFLUSSZYTOMETER
42
2.13.2.1
PRINZIP
DER
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
42
2.13.2.2
VERWENDETES
GERAET
44
2.13.2.3
GANZZELLHYBRIDISIERUNG
IN
FLUESSIGKEIT
44
3
ERGEBNISSE
47
3.1
HYBRIDISIERUNGEN
MIT
MEERRETTICHPEROXIDASE-MARKIERTEN
SONDEN
47
3.1.1
NICHTFLUORESZIERENDER
NACHWEIS
47
3.1.2
CHEMILUMINESZENZNACHWEIS
48
3.1.2.1
MEMBRANHYBRIDISIERUNGEN
48
3.1.2.2
GANZZELLHYBRIDISIERUNGEN
49
3.1.3
STEIGERUNG
DER
SENSITIVITAET
VON
GANZZELLHYBRIDISIERUNGEN
DURCH
TYRAMID-SIGNAL-AMPLIFLKATION
(TSA)
50
3.1.3.1
SPEZIFITAET
UND
ANWENDBARKEIT
50
3.1.3.2
QUANTIFIZIERUNG
DER
SIGNALSTAERKEN
UEBER
BILDVERARBEITUNG
55
3.1.3.3
QUANTIFIZIERUNGEN
MIT
DEM
DURCHFLUSSZYTOMETER
57
3.1.3.4
ANWENDBARKEIT
BEI
UMWELTPROBEN
58
II
3
2
GANZZELLHYBRIDISIERUNG
VON
CYANOBAKTERIEN
60
3.2.1
ENTWICKLUNG
VON
CYANOBAKTERIENSPEZIFISCHEN,
16S
RRNS-GERICHTETEN
SONDEN
61
3.2.2
MEMBRANHYBRIDISIERUNGEN
64
3.2.3
GANZZELLHYBRIDISIERUNGEN
68
3.2.3.1
NICHTFLUORESZIERENDER
NACHWEIS
68
32.3.2
NACHWEIS
MIT
TYRAMID-SIGNAL-AMPLIFIKATION
(TSA)
68
3.2.3.3
AUSTESTEN
DER
SPEZIFITAET
DER
SONDEN
69
3.2.4
NACHWEIS
VON
PROCHLOROCOCCUS
MARINUS
72
33
SEQUENZIERUNG
DER
16S
RRNS
VON
CYANOBAKTERIEN
UND
VERGLEICHENDE
SEQUENZANALYSE
77
3.3.1
SYNECHOCOCCUS
SP.
PCC
7001
78
3.3.2
SYNECHOCOCCUS
SP.
PCC
7335
78
3.3.3
CHROOCOCCUS
SP.
PCC
9340
79
3.3.4
CRINALIUM
EPIPSAMMUM
PCC
9333
79
3.3.5
OSCILLATORIA
SP.
PCC
7112
79
4
DISKUSSION
83
4.1
HYBRIDISIERUNGEN
MIT
MEERRETTICHPEROXIDASE-MARKIERTEN
SONDEN
83
4.1.1
NICHTFLUORESZIERENDE
DETEKTION
83
4.12
NACHWEIS
OBER
CHEMILUMINESZENZ
84
4.1.3
TYRAMID-SIGNAL-AMPLIFIKATION
(TSA)
85
4.1.3.1
SPEZIFITAET
DER
TYRAMID-SIGNAL-AMPLIFIKATION
87
4.1.32
QUANTIFIZIERUNG
DER
SIGNALSTAERKEN
BEI
E.COLI-ZELLEN
MIT
HILFE
DER
BILDVERARBEITUNG
87
4.1.3.3
QUANTIFIZIERUNG
UEBER
DAS
DURCHFLUSSZYTOMETER
90
4.1.3.4
ANWENDBARKEIT
IN
UMWELTPROBEN
90
4.1.3.5
ANDERE
ANWENDUNGEN
FLLR
TSA
BEI
BAKTERIEN
91
4.1.4
VERGLEICH
NICHTFLUORESZIERENDER
NACHWEIS/TYRAMID-SIGNAL-AMPLIFIKATION
91
42
HYBRIDISIERUNGEN
VON
CYANOBAKTERIEN
92
4.2.1
CYANOBAKTERIENSPEZIFISCHE
SONDEN
92
42.1.1
AUSTESTEN
DURCH
MEMBRANHYBRIDISIERUNGEN
92
4.2.12
GANZZELLHYBRIDISIERUNGEN
92
4.2.2
CYANOBAKTERIEN
IN
UMWELTPROBEN
95
4.2.3
GANZZELLHYBRIDISIERUNGEN
VON
PROCHLOROCOCCUS
MARINUS
95
43
VERGLEICHENDE
16S
RRNS-SEQUENZANALYSE
VON
CYANOBAKTERIEN
98
4.3.1
SYNECHOCOCCUS
SPP.
100
4.3.2
CHROOCOCCUS
SP.
PCC
9340
102
4.3.3
CRINALIUM
EPIPSAMMUM
PCC
9333
103
4.3.4
OSCILLATORIA
SP.PCC
7112
104
4.3.5
AUSBLICK
106
5
ZUSAMMENFASSUNG
107
6
ANHANG
109
7
LITERATURVERZEICHNIS
113
IV |
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