Einfluß von Transforming-Growth-Factor-b auf die zytotoxische Aktivität und Wachstumsregulation bei der akuten myeloischen Leukämie:
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1998
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I
NHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1
AKUTE
LEUKAEMIEN
1
1.2
ZELLVERMITTELTE
ZYTOTOXIZITAET
UND
EINFLUSS
VON
INTERLEUKIN-2
BEI
DER
AML
4
13
CHARAKTERISIERUNG
VON
TRANSFORMING
GROWTH
FACTOR-0
UND
SEINE
EINFLUESSE
AUF
DAS
IMMUNSYSTEM
8
1.4
REZEPTOREN
FUER
TGF-SS
UND
MOEGLICHKEITEN
AUTOKRINER
REGULATION
BEI
MYELOISCHEN
BLAESTEN
14
1.5
TUMORBEDINGTE
IMMUNSUPPRESSION
16
1.6
PROBLEMSTELLUNG
UND
ZIELSETZUNG
20
2.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
22
2.1
MATERIALIEN
22
2.1.1
REAGENZIEN
22
2.1.2
RADIOCHEMIKALIEN
23
2.13
ZYTOKINE
UND
ANTIKOERPER
23
2.1.4
ENZYME
23
2.1.5.
KIT-SYSTEME
23
2.1.6
ZELLINIEN
24
2.1.7
BAKTERIENSTAEMME
24
2.1.8
VEKTOREN
24
2.1.9
OLIGONUKLEOTIDE
24
2.1.9.1
OLIGONUKLEOTIDE
FILR
SEQUENZSPEZIFISCHE
RT-PCR
24
2.1.9.2
INTERNE
OLIGONUKLEOTIDE
(BIOTINMARKIERT)
24
2.1.10
DNA-LAENGENSTANDARDS
24
2.1.11
ARBEITSMATERIALIEN
25
2.1.12
GERAETE
25
2.1.13
HAEUFIG
BENUTZTE
PUFFER
26
2.1.14
NAEHRMEDIEN
27
2.1.15
PATIENTENDATEN
29
23
METHODEN
30
2.2.1
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
30
2.2.1.1
ISOLIERUNG
MONONUKLEAERER
ZELLEN
30
2.2.1.2
ZELLZAHLBESTIMMUNG
30
2.2.1.3
KULTUR
VON
MONONUKLEAEREN
ZELLEN
31
2.2.1.4
KULTUR
VON
ZELLINIEN
31
2.2.1.5
AKTIVIERUNG
VON
TGF-SS
31
2.2.1.6
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
32
2.2.1.7
3
H-THYMIDIN-PROLIFERATIONSTEST
32
2.2.1.8
KILLERZELLTEST
(
5L
CR-RELEASE-ASSAY)
33
2.2.1.9
TGF-SS-BIOASSAY
34
2.2.1.10
ENZYMELINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
34
2.2.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
35
2.2.2.1
PRAEPARATION
VON
GESAMTZELLULAERER
RNA
35
1.12.1
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
MIT
QIAGEN
TIP
500-SAEULEN
36
2.2.2.3
KONZENTRIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
DURCH
ISOPROPANOLFAELLUNG
37
2.2.2.4
GELELEKTROPHORESE
37
2.2.2.4.1
NATIVE
GELELEKTROPHORESE
MIT
ETHIDIUMBROMID
37
1.1.1A2
DENATURIERENDE
GELELEKTROPHORESE
VON
RNA
38
2.2.2.5
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
39
2.2.2.5.1
ELEKTROELUTION
39
1.1.15.1
ELUTION
MIT
GLASMILCH
(JETSORBYY)
39
.
1.1.15
SEQUENZSPEZIFISCHE
DNA-HYDROLYSE
MIT
BSTE
II
39
1222
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
40
2.2.2.8
TRANSKRIPTION
VON
CDNA
IN
VITRO
40
2.2.2.9
POLYMERASE-KETTENREAKTION
41
2.2.2.9.1
REVERSE-TRANSKRIPTASE-POLYMERASE-KETTENREAKTION
42
2.2.2.9.1.1
REVERSE
TRANSKRIPTION
42
2.2.2.9.1.2
AMPLIFIKATION
43
12.1.9.1
KOLONIE-PCR
44
2.2.2.10
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
BIOTIN-MARKIERTE
DNTPS45
2.2.2.11
SOUTHERN
BLOT
45
2.2.2.11.1
ALKALISCHER
KAPILLARTRANSFER
VON
DNA
AN
MEMBRANEN
45
2.2.2.11.2
HYBRIDISIERUNG
MIT
BIOTIN-MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
46
2.2.2.11.3
HYBRIDISIERUNG
MIT
BIOTIN-MARKIERTEN
DNA-FRAGMENTEN
47
2.2.2.11.4
DETEKTION
BIOTIN-MARKIERTER
DNA
DURCH
CHEMOLUMI
NESZENZ
47
2.2.2.12
QUANTIFIZIERUNG
VON
PCR-AMPLIFIKATEN
DURCH
DENSITOMETRIE
48
2.2.2.13
QUANTITATIVE
POLYMERASEKETTENREAKTION
49
2.2.2.14
NORTHERN-BLOT
51
2.2.3
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
52
2.2.3.1
KULTIVIERUNG
VON
BAKTERIEN
52
2.2.3.2
DAUERKULTUREN
VON
E.
COLI
52
2.2.3.3
TRANSFORMATION
CHEMISCH
KOMPETENTER
E.
CO/Z-ZELLEN
52
2.2.3.4
SELEKTION
REKOMBINANTER
KLONE
53
3.
ERGEBNISSE
54
3.1
BESTIMMUNG
VON
TGF-SS-PROTEIN
54
3.1.1
TGF-SS-KONZENTRATIONEN
IN
KULTURUEBERSTAENDEN
54
3.1.2
SERUMSPIEGEL
FUER
TGF-SS
BEI
PATIENTEN
MIT
AML
UND
NORMALPERSONEN
55
3.2
UNTERSUCHUNG
DER
IMMUNSUPPRESSIVEN
POTETNZ
VON
KULTURUEBERSTAENDEN
IN
VITRO
56
3.2.1
BEEINFLUSSUNG
DER
LAK-AKTIVITAET
VON
MONONUKLEAEREN
ZELLEN
DURCH
KULTURUEBERSTAENDE
56
3.2.2
LAK-AKTIVITAET
NACH
ZUSATZ
VON
KULTURUEBERSTAENDEN
UND
ANTI-TGF-SS
YY
58
3.3
EINFLUSS
VON
TGF-SSI
AUF
DIE
PROLIFERATION
VON
AML-BLASTEN
UND
MYELOISCHEN
LINIEN
59
3.4
KONSTRUKTION
EINES
STANDARDS
FUER
DIE
QUANTITATIVE
PCR
VON
TGF-SS
61
3.4.1
KLONIERUNG
EINES
TGF-SS-PCR-FRAGMENTES
IN
DEN
T7-VEKTOR
61
3.4.1.1
LIGATION
61
3.4.1.2
TRANSFORMATION
VON
KOMPETENTEN
E.
COLI
62
3.4.1.3
SELEKTION
REKOMBINANTER
KLONE
63
3.4.2
VERKUERZUNG
DES
TGF-SSI-PCR-FRAGMENTES
IM
T7-VEKTOR
63
3.4.2.1
RESTRIKTIONSANALYSE
MIT
BST
EII
63
3.4.2.2
LIGATION
UND
TRANSFORMATION
DES
VERKUERZTEN
VEKTORS
65
3.4.2.3
SELEKTION
GEEIGNETER
KLONE
65
3.4.3
TRANSKRIPTION
DER
CDNA
ZUM
RNA-STANDARD
65
3.4.4
LINEARITAET
DER
AMPLIFIKATION
VON
RNA-STANDARD
UND
GESAMT-RNA
PROBE
IN
DER
RT-PCR
66
3.4.5
KOAMPLIFIKATION
VON
CRNA-KONSTUKT
UND
RNA-PROBE
66
3.4.6
QUANTIFIZIERUNG
DER
TGF-SS|-MRNA
IN
DER
PROBE
66
3.4.6.1
SOUTHERN
BLOT
66
3.4.6.2
DENSITOMETRISCHE
AUSMESSUNG
DES
SOUTHERN
BLOTS
68
3.5.
NACHWEIS
VON
TGF-SSI
MRNA
69
3.5.1
UNTERSUCHUNG
VON
AML-BLASTEN
AUF
TGF-SSI
MRNA
69
3.5.2
DETEKTION
VON
TGF-SSI
BEI
FACS-GESORTETEN
ZELLEN
VON
AML
PATIENTEN
72
3.5.3
EXPRESSION
VON
TGF-SSI
BEI
MYELOISCHEN
ZELLINIEN
73
3.5.3.1
PCR
UND
SOUTHEM-BLOT-HYBRIDISIERUNG
73
3.5.3.2
QUANTITATIVE
PCR
73
3.5.4
UNTERSUCHUNG
DER
EXPRESSION
VON
TGF-SSI
BEI
ALL-PATIENTEN
75
3.5.5
DETEKTION
VON
TGF-SSI
MRNA
BEI
NORMALPERSONEN
75
3.5.5.1
PCR
UND
SOUTHERN-ANALYSE
75
3.5.5.2
QUANTITATIVE
PCR
76
3.6
UNTERSUCHUNG
DER
EXPRESSION
VON
TGF-SS-REZEPTOREN
77
3.6.1
DETEKTION
VON
MRNA
FUER
DEN
TGF-SS
TYPII-REZEPTOR
78
3.6.2
EXPRESSION
DES
TGF-SS
TYPIII-REZEPTORS
81
3.7
EINFLUSS
VON
INTERLEUKIN-2
AUF
DIE
TRANSKRIPTION
VON
TGF-SSI
BEI
MYELOISCHEN
ZELLINIEN
83
3.8
VERHALTEN
DER
TGF-SSI
EXPRESSION
UND
SEKRETION
BEI
AML-PATIENTEN
BZW
HEL92.1.7
UNTER
STIMULATION
MIT
TGF-SSI
85
3.8.1
STIMULATION
VON
HEL92.
1.7
MIT
TGF-SSI
85
3.8.2
STIMULATION
VON
MNC
EINES
AML-PATIENTEN
MIT
TGF-SSI
87
4.
DISKUSSION
89
4.1
EINFLUSS
VON
AML-KULTURUEBERSTAENDEN
AUF
DIE
LAK-AKTIVITAET
89
4.2
SERUMSPIEGEL
VON
TGF-SS
92
4.3
SEKRETION
VON
TGF-SSI
93
4.4
EXPRESSION
VON
TGF-SS
93
4.5
EXPRESSION
VON
REZEPTOREN
FUER
TGF-SS
95
4.6
EINFLUSS
VON
TGF-SS
AUF
DIE
PROLIFERATION
LEUKAEMISCHER
BLAESTEN
98
4.7
AUTOKRINE
REGULATION
DURCH
TGF-SS
100
4.8
EINFLUSS
VON
INTERLEUKIN-2
AUF
DIE
EXPRESSION
VON
TGF-SS
BEI
MYELOISCHEN
BLAESTEN
101
4.9
ZUSAMMENFASSENDE
DISKUSSION
UND
AUSBLICK
102
5.
ZUSAMMENFASSUNG
105
6.
LITERATURVERZEICHNIS
107
7.
ANHANG
119
7.1
ABKUERZUNGEN
119
7.2
TABELLEN
121
7.3
ABBILDUNGEN
123
7.4
LEBENSLAUF
125
7.5
EHRENWOERTLICHE
ERKLAERUNG
126 |
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