Transgenpersistenz bei der somatischen Gentherapie mit adenoviralen Vektoren:
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG
1.1 ADENOVIREN 1
1.2 DIE E1B REGION 5
1.3 GENTHERAPIE 7
1.3.1 GENTHERAPIEANSAETZE BEI KARDIOVASKULAEREN ERKRANKUNGEN 8
1.4 CGMP-ABHAENGIGE PROTEINKINASEN * 10
1.5 FRAGESTELLUNG 12
2. MATERIAL
2.1 MEDIEN 14
2.2 PLASMIDE 15
2.3 VIREN 18
2.4 ANTIKOERPER 21
2.5 PRIMER - 23
2.6 REAGENZIEN 24
2.7 PUFFER UND LOESUNGEN 25
3. METHODEN
3.1 GEWEBEKULTUR
3.1.1 293(HEK) ZELLEN 31
3.1.2 EA.HY926 ZELLEN 31
3.1.3 COS7 ZELLEN 31
3.1.4 PRIMAERE RATTENKARDIOFIBROBLASTEN 31
3.2 KONSTRUKTION UND VERMEHRUNG ADENOVIRALER VEKTOREN
3.2.1 IN F/TRO-LIGATIONS-SYSTEM 32
3.2.2 KALZIUMPHOSPHAT KOPRAEZIPITATION 33
3.2.3 PLAQUEREINIGUNG 34
3.2.4 REINIGUNG VON ADENOVIREN 34
3.2.5 INFEKTION VON ZELLEN 35
3 .2.6 ISOLIERUNG VON VIRUS-DNA 35
3.3 DN A-EXTRAKTION, CHARAKTERISIERUNG UND MANIPULATION
3.3.1 TRANSFORMATION VON E.COLI MIT PLASMID-DNA 36
3.3.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIENZELLEN 36
3.3.2.1 MINIPRAEPARATION 36
3.3.2.2 MAXIPRAEPARATION 37
3.3.3 DNA-SPALTUNG MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN UND GELELEKTROPHORESE 3
7
3.3.4 LIGATION 38
3.3.5 GESAMT DNA-EXTRAKTION MITTELS SORIANOLYSE 38
3.3.6 POLYMERASE-KETTENREAKTION 39
3.3.7
LN VIVO MARKIERUNG VON DNA 39
3.3.8 DIG-MARKIERUNG VON DNA 40
3.3.9 SOUTHERN ANALYSE 41
3.4 RNA-EXTRAKTION UND CHARAKTERISIERUNG
3.4.1 RNA-ISOLIERUNG 41
3.4.2 HERSTELLUNG DNA-FREIER RNA-PRAEPARATIONEN 42
3.4.3 REVERSE-TRANSKRIPTASE-POLYMERASE-KETTENREAKTION 42
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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T" 00
O\
3.4.4 NORTHERN ANALYSE 43
3.5 PROTEINANALYSE
3.5.1 EXTRAKTION VON PROTEINEN 43
3.5.2 GEWINNUNG VON GST-FUSIONSPROTEINEN 44
3.5.3 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 44
3.5.4 WESTERN ANALYSE 45
3.5.5 IMMUNFLUORESZENZ 45
3.5.6 ZYTOTOXIZITAETSBESTIMMUNG (LDH FREISETZUNG) 46
3.5.7
IN VITRO
PHOSPHORYLIERUNG VON GEBUNDENEN PROTEINEN 47
V
4. ERGEBNISSE
4.1 NACHWEIS DER REPLIKATIONSFAEHIGKEIT VERSCHIEDENER ADENOVIRALER
VEKTOREN IN
NICHT PERMISSIVEN ZELLINIEN 48
4.2 ANALYSE DER INFEKTIOESITAET VERSCHIEDENER ADENOVIRALER VEKTOREN 49
4.3 BESTIMMUNG DER ZYTOTOXIZITAET VERSCHIEDENER ADENOVIRALER VEKTOREN 50
4.4 RNA-ANALYSE VERSCHIEDENER ADENOVIRALER REGIONEN 55
4.5 SEQUENZVERGLEICH DER E1B REGION 58
4.6 NACHWEIS DES DURCHLESENS IN DIE E1B55K REGION - 60
4.7 NACHWEIS VON EIA UND E1B55K PROTEIN 63
4.8 /-F/TRO-PHOSPHORYLIERUNG DES VERKUERZTEN E1B55K PROTEINS 65
4.9 VEKTORSTABILITAET IN ZELLKULTUREN DURCH REPLIKATION 66
4.10 ANALYSE DES PROLIFERATIONSVERHALTENS PRIMAERER
RATTENKARDIOFIBROBLASTEN NACH
ADENOVIRALEM GENTRANSFER 70
4.11 ANALYSE DER KARDIOFIBROBLASTENPROLIFERATION NACH AKTIVIERUNG DER
ENDOGENEN
CGMP-ABHAENGIGEN PROTEINKINASE ISS 73
4.12 KURZZEITANALYSE DER AKT- UND MAPK-SIGNALTRANSDUKTIONSWEGE 74
4.13 LANGZEITANALYSE DER AKT UND MAPK SIGNALTRANSDUKTIONSWEGE 78
5. DISKUSSION
5.1 DETEKTION DA- AUTOREPLIKATION REKOMBINANTER, ADENOVIRALER VEKTOREN
UND IHRE
RELEVANZ FUER EINE VERLAENGERTE TRANSGENPERSISTENZ 79
5.2 ANALYSE DES MECHANISMUS DA AUTOREPLIKATION AUF TRANSKRIPTIONSEBENE
83
5.3 ANALYSE DES MECHANISMUS DA AUTOREPLIKATION AUF PROTEINEBENE 85
5.4 REGULATION DA PDGF-BB STIMULIERTEN PRIMAEREN
RATTENKARDIOFIBROBLASTEN-
PROLIFERATION 87
6. ZUSAMMENFASSUNG
6.1 DEUTSCHSPRACHIG 89
6.2 ENGLISCHSPRACHIG 91
LITERATURVERZEICHNIS
93
ABKUERZUNGEN
112
LEBENSLAUF
114
10
.
VEROEFFENTLICHUNGEN 115 |
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