Cyclodextrin-Stoffwechsel von Klebsiella oxytoca:
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| adam_text | - (OIO O CYCLODEXTRIN-STOFFWECHSEL VON KLEBSIELLA OXYTOCA DISSERTATION
DER FAKULTAET FUER BIOLOGIE DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN
VORGELEGT VON MARKUS PAJATSCH AUS MUENCHEN IM FEBRUAR 1999
INHALTSVERZEICHNIS A. EINLEITUNG 1-13 1 . CYCLODEXTRINE, IHRE SYNTHESE
UND IHR ABBAU 1 2. STAERKEABBAU UND CYCLODEXTRIN-STOFFWECHSEL IN 4
KLEBSIELLA OXYTOCA M5AL 3. PORINE 6 4. BINDEPROTEIN-ABHAENGIGE
ABC-TRANSPORTER 9 B . MATERIAL UND METHODEN 14-29 1. VERWENDETE
BAKTERIENSTAEMME, PLASMIDE UND OLIGONUKLEOTIDE 14 2 . ENZYME UND
BESONDERE CHEMIKALIEN 18 3 . ANZUCHT VON ORGANISMEN 19 4.
MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 19 5. MUTAGENESE VON KLEBSIELLA OXYTOCA 21
5.1. INTEGRATION VON MUTATIONEN IN DAS CHROMOSOM VON KLEBSIELLA OXYTOCA
21 5.2. UV-MUTAGENESE 22 5.3. TRANSPOSON-MUTAGENESE 22 6. IMMUNOLOGISCHE
METHODEN 23 7. BIOCHEMISCHE METHODEN 23 7.1. BESTIMMUNG DER
SS-GALAKTOSIDASE- UND SS-GLUKURONIDASE-AKTIVITAET 23 7.2.
A-CYCLODEXTRIN-GLYKOSYLTRANSFERASE-ABHAENGIGE UMWANDLUNG VON
CYCLODEXTRINEN 23 7.3. MVJFRO-SYNTHESE VON [L^C] RADIOAKTIV MARKIERTEN
SUBSTRATEN FUER DIE 24 CYCLODEXTRIN-PERMEASE 7.3.1. SYNTHESE VON [U-^C]
RADIOAKTIV MARKIERTEM A-CYCLODEXTRIN MIT HOHER 24 SPEZIFISCHER AKTIVITAET
7.3.2. SYNTHESE VON [L^C] RADIOAKTIV MARKIERTER MALTOHEXAOSE 25 7.4.
AUFNAHME RADIOAKTIV MARKIERTER SUBSTANZEN 26 7.5. UEBERPRODUKTION UND
REINIGUNG DES CYCLODEXTRIN-PORINS CYMA AUS 27 KLEBSIELLA OXYTOCA 8 .
DATENVERARBEITUNG 2 9 C. ERGEBNISSE 30-82 30 1. GENETISCHE
CHARAKTERISIERUNG DES CYCLODEXTRIN-STOFFWECHSELS VON KLEBSIELLA OXYTOCA
M5AL 1.1. KOMPLETTIERUNG DER NUKLEOTIDSEQUENZ DES FUER DAS WACHSTUM AUF
CYCLODEXTRINEN ESSENTIELLEN GENOM-ABSCHNITTS UND DESSEN UNMITTELBARER
NACHBARSCHAFT 1.1.1. SUBKLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DES 5 KB GROSSEN
GENOM-ABSCHNITTS MIT DEM 3~-ENDE VON CYMH UND DER DARAN ANSCHLIESSENDEN
REGION 1.1.2. ANALYSE DER ERHALTENEN NUKLEOTIDSEQUENZ 1.1.3. ANALYSE DER
AUS DER NUKLEOTIDSEQUENZ ABGELEITETEN GENPRODUKTE 1.2. PHYSIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN ZUR NOTWENDIGKEIT DER EINZELNEN CYM-GENE FUER DAS WACHSTUM
AUF CYCLODEXTRINEN 1.2.1. PLASMIDKODIERTER CYCLODEXTRINABBAU IM
HETEROLOGEN SYSTEM ESCHERICHIA COLI 1.2.1.1. KONSTRUKTION VON PCYML
1.2.1.2. KONSTRUKTION VON IN FRAME DELETIONEN IN EINZELNEN CYM-GENEN
1.2.1.3. AUSWIRKUNGEN VON DELETIONEN IN VERSCHIEDENEN CYM-GENEN FUER DAS
WACHSTUM 39 AUF CYCLODEXTRINEN 1.2.2. UEBERTRAGUNG VON PLASMIDKODIERTEN
MUTATIONEN IN DEN FUER DAS WACHSTUM AUF 41 CC-CD ESSENTIELLEN CYM-GENEN
AUF DAS CHROMOSOM VON KLEBSIELLA OXYTOCA 1.3. EINFLUSS DES
INTRAZELLULAEREN MALTODEXTRIN-STOFFWECHSELS AUF DEN ABBAU VON
CYCLODEXTRINEN 30 31 32 34 36 36 36 37 43 2. CHARAKTERISIERUNG DES
SUBSTRATSPEKTRUMS DER CYCLODEXTRIN-PERMEASE 44 2.1. IN VILRO-SYNTHESE
VON [ 14 C] RADIOAKTIV MARKIERTEN SUBSTRATEN FUER DIE 44
CYCLODEXTRIN-PERMEASE 2.1.1. DURCH AMYLOMALTASE UND
A-CYCLODEXTRIN-GLYKOSYLTRANSFERASE KATALYSIERTE 44 UMWANDLUNG VON [U- 14
C] MALTOSE IN [U- 14 C] CC-CD 2.1.2. CYCLODEXTRINASE-VERMITTELTE
LINEARISIERUNG VON [ 14 C] CC-CD ZU 48 [ 14 C] MALTOHEXAOSE 2.2.
UNTERSUCHUNGEN ZUR AUFNAHME VON [1 4 C] RADIOAKTIV MARKIERTEN SUBSTRATEN
DURCH 49 DIE CYCLODEXTRIN-PERMEASE 2.2.1. KM-UND VMAX-BESTIMMUNG FUER DIE
AUFNAHME VON [ 14 C] A-CD UND 49 [ 14 C] MALTOHEXAOSE 2.2.2. HEMMUNG DER
AUFNAHME VON [ 14 C] A-CD DURCH NICHT-RADIOAKTIV MARKIERTE 50 CYCLISCHE
UND LINEARE MALTODEXTRINE 2.2.3. ANALYSE DER UMWANDLUNG VON [ 14 C] A-CD
IN NIEDERMOLEKULARE INTRAZELLULAERE 51 SUBSTANZEN 2.3.
CYCLODEXTRIN-PERMEASE-ABHAENGIGES WACHSTUM AUF LINEAREN MALTODEXTRINEN
VON 53 ESCHERICHIA COLI GM15 2.3.1- EINFLUSS DES
CYCLODEXTRIN-BINDEPROTEINS CYME UND DER LAENGE DER EINGESETZTEN 53
SUBSTRATE 2.3.2. ABHAENGIGKEIT DES WACHSTUMS AUF LINEAREN MALTODEXTRINEN
VON DER INDUKTION DES 55 CYM-SYSTEMS 2.4. FUNKTIONALITAET VON
HYBRID-PERMEASEN AUS CYCLODEXTRIN- UND MALTODEXTRIN- 55
PERMEASEKOMPONENTEN IM WACHSTUM AUF CYCLISCHEN UND LINEAREN
MALTODEXTRINEN 3. CYMA, EIN CYCLODEXTRIN-PORIN 56 3.1. FUNKTIONALITAET
VON CYMA ALS MALTOPORIN 57 3.2. UEBERPRODUKTION UND REINIGUNG VON CYMA 59
4. REGULATION DES CYCLODEXTRIN-STOFFWECHSELS VON KLEBSIELLA OXYTOCA 64
4.1. AUFBAU EINES MESSSYSTEMS AUF DER GRUNDLAGE VON REPORTERGENFUSIONEN
65 4.1.1 KONSTRUKTION VON PLASMIDKODIERTEN REPORTERGENKASSETTEN, IN
DENEN DIE INTERGENE 65 REGION ZWISCHEN CYMA UND CYME BIDIREKTIONAL UND
TRANSLATIONAL MIT LACZ UND UIDA GEKOPPELT IST 4.1.2 INTEGRATION DER
REPORTERGENKASSETTEN IN DAS CHROMOSOM VON KLEBSIELLA OXYTOCA 67 4.2.
CYCLODEXTRIN-ABHAENGIGE INDUKTION DES CYM-SYSTEMS 69 4.3. EINFLUSS
VERSCHIEDENER CYM- UND MAZ-GENPRODUKTE AUF DAS WACHSTUM AUF CYCLISCHEN
UND LINEAREN MALTODEXTRINEN UND AUF DIE INDUKTION DES CYM-SYSTEMS 74
4.3.1. KONSTRUKTION VON KLEBSIELLA OXYTOCA STAEMMEN MIT INTEGRIERTER
REPORTERGEN- 74 KASSETTE UND DELETIONEN IN CYM- UND/ODER MAZ-GENEN
4.3.2. EINFLUSS VERSCHIEDENER CYM- UND MA/-GENPRODUKTE AUF DAS WACHSTUM
AUF A-CD 75 UND DIE A-CD-ABHAENGIGE INDUKTION DES CYM-SYSTEMS 4.3.3.
EINFLUSS VERSCHIEDENER CYM- UND MAZ-GENPRODUKTE AUF DAS WACHSTUM AUF
LINEAREN 77 MALTODEXTRINEN UND DIE MALTOHEPTAOSE-ABHAENGIGE INDUKTION DES
CYM-SYSTEMS 4.4. BESTIMMUNG DES TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTS VOR CYME 79
4.5. ISOLIERUNG VON REGULATOREN DES CYM-SYSTEMS 81 D. DISKUSSION 83-93
1. AUFNAHME UND INTRAZELLULAERER METABOLISMUS VON CYCLODEXTRINEN 8 3 1.1.
TRANSPORT UEBER DIE AEUSSERE MEMBRAN 85 1.2. TRANSPORT UEBER DIE
CYTOPLASMAMEMBRAN 86 1.2.1. SYNTHESE RADIOAKTIV MARKIERTER SUBSTRATE FUER
DIE CYCLODEXTRIN-PERMEASE 86 1.2.2. CHARAKTERISIERUNG DER
CYCLODEXTRIN-PERMEASE 87 1.3. INTRAZELLULAERE UMWANDLUNG DER
CYCLODEXTRINE IN NIEDERMOLEKULARE SUBSTANZEN 89 2. REGULATION DES
CYCLODEXTRIN-STOFFWECHSELS 90 2.1. INDUKTION DES CYM-SYSTEMS 91 2.2.
REGULATOREN DES CYM-SYSTEMS 92 E. ZUSAMMENFASSUNG 94-95 F. LITERATUR
96-103 ANHANG 1-5
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