Erzeugung und Charakterisierung von REMI-Mutanten: die Rolle dreier neuer Proteine, Drainin, Unvolvin und DdnuclPLC, bei der Fusion und der Organisation von Membransystemen sowie der Signalübertragung
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1999
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
EINLEITUNG
6
1.1.
MUTAGENESE
6
1.2.
MEMBRANFUSION
9
1.3.
MEMBRANFUSIONSSTOERUNGEN
14
2.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
18
2.1.
MATERIALIEN
18
2.1.1.
REAGENZIEN
18
2.1.2.
RADIOCHEMIKALIEN
19
2.1.3.
ANTIBIOTIKA
19
2.1.4.
ANTIKOERPER
19
2.1.5.
ENZYME
20
2.1.6.
INHIBITOREN
20
2.1.7.
KITS
UND
MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS
21
2.1.8.
SONSTIGE
MATERIALIEN
21
2.1.9.
PUFFER
UND
SELBSTHERGESTELLTE
LOESUNGEN
23
2.1.10.
MEDIEN
UND
PUFFER
FUER
DIE
ZELLKULTUR
25
2.1.10.1.
MEDIEN
FUER
DIE
DICTYOSTELIUM-DISCOIDEUM-}^A\\XA
25
2.1.10.2.
MEDIEN
FUER
DIE
KULTUR
VON
ESCHERICHIA
COLI
26
2.1.11.
OLIGONUKLEOTIDE
27
2.1.12.
BAKTERIENSTAEMME
29
2.1.13.
D.-DISCOIDEUM-SVAWNS
30
2.1.14.
HEFE-STAEMME
30
2.1.15.
PHAGENBAENKE
30
2.1.16.
VEKTOREN
30
2.2.
GERAETE
30
2.2.1
ZENTRIFUGEN
UND
ROTOREN
30
2.2.2.
STROMVERSORGUNGSGERAETE
31
2.2.3.
MIKROSKOPE,
KAMERAS
UND
VIDEORECORDER
31
2.2.4.
WAAGEN
31
2.2.5.
LABORSCHUETTLER
31
2.2.6.
FLUORIMETER
UND
SEINE
PARAMETEREINSTELLUNG
31
2.2.7.
SONSTIGE
GERAETE
32
2.3.
METHODEN
33
2.3.1.
PRAEPARATIVE
METHODEN
33
2.3.1.1.
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
D.
DISOIDEUM
33
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
MIT
HILFE
EINES
CSCL-GRADIENTEN
33
INHALTSVERZEICHNIS
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
MIT
DER
PHENOL-CHLOROFORM-METHODE
34
2.3.1.2.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
34
PLASMID-MINI-PRAEPARATION
34
PLASMID-MIDI
UND
-MAXI-PRAEPARATION
34
2.3.1.3.
PRAEPARATION
VON
GESAMT-RNA
AUS
D.
DISCOIDEUM
3
5
2.3.1.4.
REINIGUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
35
2.3.1.5.
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
36
2.3.2.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
37
2.3.2.1.
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
37
RESTRIKTIONSVERDAU
37
LIGATION
37
DEPHOSPHORYLIERUNG
DES
5'
-ENDES
VON
DNA-FRAGMENTEN
37
PHOSPHORYLIERUNG
DES
5'-ENDES
VON
DNA-FRAGMENTEN
37
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
38
POLYMERASE-KETTENREAKTION
38
2.3.2.2.
PHAGENBANK-SCREEN
39
2.3.2.3.
DNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
UND
SOUTHERN-BLOT
40
2.3.2.4.
RNA-GELELEKTROPHORESE
UND
NORTHERN-BLOT
40
2.3.2.5.
KOLONIE-BLOT
41
2.3.2.6.
HYBRIDISIERUNG
42
2.3.2.7.
FAELLUNG
VON
DNA
42
ETHANOLFAELLUNG
42
ISOPROPANOLFAELLUNG
42
2.3.2.8.
SEQUENZIERUNG
42
2.3.3.
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
43
2.3.3.1.
ANZUCHT
VON
D.
DISCOIDEUM
AUF
AGARPLATTEN
43
2.3.3.2.
ANZUCHT
VONSS.
DISCOIDEUM
IM
FLUESSIGMEDIUM
43
2.3.3.3.
KONSERVIERUNG
VON
D.
DISCOIDEUM
44
ZELLEN
44
SPOREN
44
2.3.3.4.
ENTWICKLUNG
VONSS.
DISCOIDEUM
44
2.3.3.5.
TRANSFORMATION
VON
D.
DISCOIDEUM
45
2.3.3.6.
AUFSCHLUSS
UND
FAKTIONIERUNG
VON
D.-DISCOIDEUM-ZEUEEN
45
DIFFERENTIELLE
ZENTRIFUGATION
45
SACCHAROSE-DICHTE-GRADIENT
46
2.3.3.7.
KREUZUNG
VON
D.
DISCOIDEUM
46
DIPLOIDISIERUNG
46
HAPLOIDISIERUNG
UND
ANALYSE
DER
SEGREGANTEN
47
2.3.3.8.
TRANSFORMATION
VONSS.
COLI
47
HERSTELLEN
KOMPETENTER
ZELLEN
FUER
ELEKTROPORATION
47
HERSTELLEN
KOMPETENTER
ZELLEN
FUER
HITZESCHOCKTRANSFORMATION
48
ELEKTROPORATION
48
INHALTSVERZEICHNIS
HITZESCHOCK
49
2.3.3.9.
ADHAESIONSTEST
49
2.3.3.10.
BESTIMMUNG
VON
PHOSPHODIESTERASE
UND
PHOSPHODIESTERASE-INHIBITOR
49
2.3.3.11.
SELEKTION
AUF
CHEMOTAXIS-MUTANTEN
50
2.3.3.12.
QUALITATIVER
CHEMOTAXISTEST
51
2.3.3.13.
QUANTITATIVER
CHEMOTAXISTEST
52
2.3.3.14.
PHOTOTAXISTEST
54
2.3.3.15.
PHAGOZYTOSETEST
54
WACHSTUM
IN
EINER
BAKTERIENSUSPENSION
E.COLI
B/R
54
AUFNAHME
VON
HEFEZELLEN
54
2.3.3.16.
PINOZYTOSETEST
55
2.3.3.17.
EXOZYTOSETEST
5
5
2.3.3.18.
BESTIMMUNG
DES
ZELLVOLUMENS
56
2.3.3.19.
HYPO
UND
HYPERTONISCHER
SCHOCK
VON
D.
DISCOIDEUM
56
2.3.3.20.
MIKROSKOPIE
57
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
57
CALCOFLUOR-FAERBUNG
59
AGAR-OVERLAY-TECHNIK
59
REFLEKTIONS-INTERFERENZ-KONTRAST-MIKROSKOPIE
60
RASTERELEKTRONENMIKROKOPIE
60
TRANSMISSIONS-ELEKTRONENMIKROSKOPIE
61
2.3.4.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
62
2.3.4.1.
SDS-GELELEKTROPHORESE
62
2.3.4.2.
ZWEIDIMENSIONALE
GELELEKTROPHORESE
63
2.3.4.3.
WESTEM-BLOTTING
65
WESTERN-BLOTTING
"
FEUCHT"
65
WESTERN-BLOTTING
"HALBTROCKEN"
65
2.3.4.4.
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
IM
WESTERN-BLOT
MIT
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
65
2.3.4.5.
PROTEIN-EXTRAKTION
66
2.4.
PROGRAMME
66
3.
RESULTATE
67
3.1.
VORBETRACHTUNGEN
ZUM
ELTEMSTAMM
HG592
UND
SEINEN
PHAENOTYPISCHEN
MERKMALEN
67
3.2.
RESTRIKTIONSENZYM-VERMITTELTE
INTEGRATION
(REMI)
-
TRANSFORMATION
UND
SELEKTION
70
3.3.
DIE
MUTANTE
HG1648
84
3.3.1.
PHAENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
84
3.3.1.1.
DER
ADHAESIONSDEFEKT
84
3.3.1.2.
DER
PHAGOZYTOSEDEFEKT
89
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.1.3.
DER
ZELLTEILUNGSDEFEKT
93
3.3.1.4.
DER
VAKUOLENDEFEKT
94
3.3.2.
GENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTANTE
HG1
648
95
3.3.2.1.
KLONIERUNG
DES
IN
HG1648
AUSGESCHALTETEN
GENS
95
3.3.2.2.
DER
GENOTYP
DER
MUTANTE
HG1648
IST
ZUSAETZLICH
ZUR
REMI-INTEGRATION
DURCH
EINE
TRANSLOKATION
CHARAKTERISIERT
102
3.3.2.3.
DRAININ
-
NUKLEOTIDSEQUENZ
UND
PRIMAERSTRUKTUR
DES
PROTEINS
106
3.3.2.4.
DAS
GEN
DDNUCLPLC
UND
PRIMAERSTRUKTUR
DES
PROTEINS
PDDNUCLPLC
109
3.3.3.
GEZIELTE
AUSSCHALTUNG
DES
DRAININ-GENS
114
3.3.3.1.
KONSTRUKT
UND
TRANSFORMATION
114
3.3.3.2.
PHAENOTYPISCHE
ANALYSE
DER
DRAININ-NULL-MUTANTEN
119
3.3.3.3.
EFFEKTE
VON
CYTOCHALASIN,
KALZIUMIONEN
UND
DER
ZELLTEILUNG
AUF
DIE
VAKUOLE
133
3.3.4.
LOKALISIERUNG
VON
GFP-DRAININ
135
3.3.5.
EINE
NUKLEAERE
PHOSPHOLIPASE
C
VOND.
DISCOIDEUM-,
ERZEUGUNG
VON
NULL-MUTANTEN
149
3.3.5.1.
KONSTRUKT
UND
TRANSFORMATION
149
3.3.5.2.
GENOTYPISCHE
ANALYSE
DER
DDNUCLPLC-NULL-MUTANTEN
149
3.3.5.3.
PHAENOTYPISCHE
ANALYSE
DER
DDNUCLPLC-NULL-MUTANTEN
151
3.3.6.
GFP-DDNUCLPLC
158
3.4.
DIE
MUTANTE
HG1645
160
3.4.1.
PHAENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTANTE
HG1
645
160
3.4.2.
GENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTANTE
HG1
645
165
3.4.2.1
SOUTHEMBLOTANALYSE
UND
KLONIERUNGSSTRATEGIE
165
3.4.2.2.
DAS
GEN
UNVOLVIN
UND
DAS
PROTEIN
PUNVOLVIN
168
3.4.3.
GEZIELTE
AUSSCHALTUNG
DES
UNVOLVIN-GENS
173
3.4.3.1.
KONSTRUKTE
UND
TRANSFORMATION
173
3.4.3.2.
GENOTYPISCHE
ANALYSE
DER
UNVOLVIN-NULL-MUTANTEN
174
3.4.3.3.
PHAENOTYPISCHE
ANALYSE
DER
UNVOLVIN-NULL-MUTANTEN
177
3.4.4.
CHARAKTERISIERUNG
DER
TWISTER-KOERPER
184
3.4.5.
DIE
TWISTER
SIND
NICHT
DAS
RESULTAT
EINES
DEFEKTES
IM
ENDOLYSOSOMALEN
KOMPARTMENT
188
4.
DISKUSSION
190
4.1.
RESTRIKTIONSENZYM-VERMITTELTE
INTEGRATION
(REMI)
ZUR
ISOLIERUNG ENTWICKLUNGSGESTOERTER
MUTANTEN
190
4.2.
MUTANTEN
MIT
DEFEKTEN
BEI
DER
SUBSTRATADHAESION
191
4.2.1.
DIE
DRAININ-NULL
MUTANTE
IMPLIZIERT
FIIR
DRAININ
EINE
ROLLE
IM
ZYKLUS
DER
KONTRAKTILEN
VAKUOLE
193
4.2.2.
DRAININ
IST
AUF
DEN
KONTRAKTILEN
VAKUOLEN
LOKALISIERT
196
4.2.3.
DER
CV-ZYKLUS
-
EINE
KONTRAKTION?
197
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.4,
WELCHE
GENAUE
FUNKTION
ERFUELLT
DRAININ?
199
4.3.
DDNUCLPLC
-
EINE
HISTIDINREICHE
PHOSPHATIDYLINOSITOL
SPEZIFISCHE
PHOSPHOLIPASE
C
VON
DICTYOSTELIUM
DISCOIDEWN
201
4.3.1.
FUNKTION
VON
DDNUCLPLC
201
4.3.2.
DDNUCLPLC
IST
IN
DEN
KEMKAPPEN
LOKALISIERT
202
4.4.
UNVOLVIN
204
4.4.1.
DER
PHAENOTYP
DER
UNVOLVIN-NULL-MUTANTEN
205
4.4.2.
APOPTOSE
IN
UNVOLVIN-NULL-MUTANTEN?
208
5.
ZUSAMMENFASSUNG
211
6.
LITERATURVERZEICHNIS
213
7.
ABKUERZUNGEN
UND
EINHEITEN
238
7.1.
ABKUERZUNGEN
238
7.2.
EINHEITEN
241 |
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