Einsatz sequenzspezifischer DNA Rekombination durch ggd Resolvase zur Untersuchung dynamischer Veränderungen der DNA Tertiärstruktur:
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1998
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I
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
DNA
TOPOLOGIE
UND IHRE
BIOLOGISCHE
FUNKTION
1
1.2
DNA
TOPOISOMERASEN
4
1.3
YYTWIN
SUPERCOILED
DOMAIN
MODEL
"
UND
DIE
YYTOPOLOGISCHE
KOPPLUNG
"
7
1.4
DIE
SEQUENZSPEZIFISCHE
REKOMBINATION
DER
76
RESOLVASE
ALS
WERKZEUG
ZUR
UNTERSUCHUNG
INDUZIERTER
VERAENDERUNGEN
DER
DNA
TOPOLOGIE
10
1.4.1
SEQUENZSPEZIFISCHE
REKOMBINATION;
TN3/Y6-FAMILIE
10
1.4.2
RES
SEQUENZ
12
1.4.3
76
RESOLVASE
13
1.4.4
REKOMBINATION
MIT
76
RESOLVASE
13
1.4.5
FUNKTION
DER
SUPERHELICES
BEI
DER
SEQUENZSPEZIFISCHEN
REKOMBINATION
DER
YOE
RESOLVASE
15
1.5
TRANSKRIPTION
AKTIVIERT
SEQUENZSPEZIFISCHE
REKOMBINATION:
EIN
MODELLSYSTEM
16
1.6
ZIEL
DIESER
ARBEIT
17
2
MATERIAL
UND
METHODEN
_
12
2.1
ABKUERZUNGEN
19
2.2
CHEMIKALIEN
21
2.3
STAEMME
21
2.4
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
22
2.5
PLASMIDE
22
2.6
METHODEN
23
2.6.1
PLASMIDKONSTRUKTIONEN
23
2.6.2
ISOLIERUNG
VON
DNA
28
2.6.3
ISOLIERUNG
VON
MRNA
28
2.6.4
CDNA
SYNTHESE
28
2.6.5
SOUTHEM-BLOTANALYSE
28
2.6.6
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
30
2.6.7
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
30
2.6.8
POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE
30
II
2.6.9
HERSTELLUNG
DER
GAL4-AFFINITAETSSAEULE
30
2.6.10
HEPARINSAEULE
31
2.6.11
PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG
31
2.6.12
ENZYMKATALYTISCHE
REAKTIONEN
31
2.6.13
HERSTELLUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
33
2.6.14
DNA
SEQUENZANALYSE
33
2.6.15
ZELLINIEN,
KULTURBEDINGUNGEN
UND
SUSPENSION
33
2.6.16
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
34
2.6.17
TRANSFEKTION
DER
NIH3T3-ZELLEN
MIT
PLASMID
DNA
34
2.6.18
HERSTELLUNG
VON
ZELLKLONEN
MIT
DEM
Y6
RESOLVASEGEN
35
2.6.19
INDUZIERTE
EXPRESSION
VON
YB
RESOLVASE
DURCH
A-INTERFERON
AUS
MAUS
35
2.6.20
X-GAL-FAERBUNG
35
3
ERGEBNISSE
37
3.1
REINIGUNG
DER
GAL4-T7
RN
AP
AUS
E.
COLI
37
3.1.1
UEBERSICHT
ZUR
REINIGUNG
VON
GAL4-T7
RNAP
37
3.1.2
BAKTERIENSTAMM
37
3.1.3
ZELLAUFSCHLUSS
UND
ENTFERNUNG
DER
DNA
39
3.1.4
AMMONIUMSULFAT-PRAEZIPITATION
39
3.1.5
HEPARIN-CHROMATOGRAPHIE
39
3.1.6
DNA-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
40
3.1.7
CHARAKTERISIERUNG
DER
GEREINIGTEN
GAL4-T7
RNAP
40
3.1.8
ZUSAMMENFASSUNG
ZUR
GAL4-T7
RNAP
REINIGUNG
42
3.2
AUSWIRKUNG
DER
VERANKERUNG
AUF
DIE
TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET
DER
GAL4-T7
RNAP
42
3.3
UNTERSUCHUNG
DER
TOPOLOGISCHEN
KOPPLUNG
MIT
DER
REKOMBINATION
DER
Y6
RESOLVASE
44
3.4
UNTERSUCHUNG
DER
ZWEI
INDUZIERTEN
TOPOLOGISCHEN
DOMAENEN
46
3.5
REGULATION
DER
INDUZIERTEN
SEQUENZSPEZIFISCHEN
REKOMBINATION
DURCH
TOPOISOMERASE
47
3.5.1
INHIBITION DER
REKOMBINATION
MIT
SUPERHELIKALEM
PZWX
DURCH
TOPOISOMERASE
I
48
3.5.2
INHIBITION
DER
TRANSKRIPTIONSINDUZIERTEN
REKOMBINATION
DURCH
TOPOISOMERASE
I
50
3.5.3
INHIBITION DER
REKOMBINATION
MIT
RELAXIERTEM
PLASMID
PZWXTOPOL
50
3.5.4
ZUSAMMENFASSUNG:
INHIBITION
DER
REKOMBINATION
DURCH
TOPOISOMERASE
I
52
IN
3.5.5
REGULATION
DER
INDUZIERTEN
REKOMBINATION
DURCH
TOPOISOMERASE
N
54
3.6
UNTERSUCHUNG
EINES
DNA-PROTEIN
KOMPLEXES
ALS
BARRIERE
FUER
DIE
DIFFUSION
DER
INDUZIERTEN
SUPERHELICES
55
3.7
NACHWEIS
EINES
GRADIENTEN
VON
INDUZIERTEN
DNA
SUPERHELICES
56
3.8
AUFBAU
EINES
IN
VIVO
SYSTEMS
FUER
EUKARYONTEN
59
3.8.1
DAS
EXPRESSIONSPLASMID
PY6
60
3.8.2
DAS
INDIKATORPLASMID
PIN
66
4
_
DISKUSSION
_
68
4.1
SEQUENZSPEZIFISCHE
REKOMBINATION
ALS
WERKZEUG
ZUR UNTERSUCHUNG
DER
INDUZIERTEN
SUPERHELICES
68
4.2
GAL4-T7
RNAP
ALS
VERANKERTES
RNAP
MOLEKUEL
69
4.3
DAS
YYTWIN
SUPERCOILED
DORNAIN
MODEL
"
UND
DIE
INDUKTION
DER
SUPERHELICES
DURCH
GAL4-T7
RNAP
70
4.4
DIE
REGULATION
DER
INDUZIERTEN
SEQUENZSPEZIFISCHEN
REKOMBINATION
DURCH
TOPOISOMERASE
I
73
4.5
ATTP-IHF
KOMPLEX
ALS
BARRIERE
FUER
DIE
DIFFUSION
DER
INDUZIERTEN
SUPERHELICES
76
4.6
DER
GRADIENT
DER
INDUZIERTEN
SUPERHELICES
77
4.7
AUFBAU
EINES
IN
VIVO
SYSTEMS
FUER
EUKARYONTEN
78
5
_
ZUSAMMENFASSUNG
_
GL
6
_
LITERATUR
82 |
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