Biochemische und funktionelle Charakterisierung des neuen Zytokins ATAC:
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1998
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INHALTSVERZEICHNIS
1
INHALTSVERZEICHNIS
VERZEICHNIS
DER
ABBILDUNGEN
UND
TABELLEN
.
4
ABKUERZUNGEN
.
6
1.
EINLEITUNG
.
9
1.1
DIE
ZENTRALE
FUNKTION
DER
T-ZELLEN
IM
IMMUNSY
STEM
.
9
1.1.1
DIE
AKTIVIERUNG
VON
T-ZELLEN
IM
RAHMEN
DER
IMMUNANTWORT
.
10
1.1.2
MOLEKULARE
MECHANISMEN
DER
T-ZELLAKTIVIERUNG
.
11
1.2
IDENTIFIZIERUNG
DES
ATAC-GENS
ALS
T-ZELLSPEZIFISCHES
AKTIVIERUNGSGEN
.
14
1.3
DIE
CHEMOKIN-SUPERFAMILIE:
STRUKTUR
UND
FUNKTION
.
15
1.3.1
CHEMOKIN-REZEPTOREN
UND
SIGNALTRANSDUKTION
.
18
1.3.2
MIGRATION
UND
EXTRAVASATION
VON
LEUKOZYTEN
.
20
1.3.3
DIE
ROLLE
DER
CHEMOKINE
IN
DER
PATHOGENESE
.
21
1.4
ZIELE
DER
ARBEIT
.
22
2.
MATERIAL
UND METHODEN
.
23
2.1
HERKUNFT
DER
VERWENDETEN
MATERIALIEN
UND
CHEMIKALIEN
.
23
2.2
HERKUNFT
DER
VERWENDETEN
ENZYME
.
24
2.3
HERKUNFT
DER
VERWENDETEN
RADIOCHEMIKALIEN
.
24
2.4
HERKUNFT
DER
VERWENDETEN
BAKTERIENSTAEMME
UND
BAKTERIOPHAGEN
.
25
2.5
HERKUNFT
DER
VERWENDETEN
MAEUSE
.
25
2.6
MEDIEN,
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
25
2.7
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
26
2.7.1
PLASMIDKONSTRUKTIONEN
.
26
2.7.2
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
27
2.7.3
KLONIERUNG
DER
MURINEN
ATAC
CDNA
.
31
2.7.4
PRAEPARATION
VON
DOPPELSTRAENGIGER
PLASMID-DNA
.
32
2.7.5
ISOLIERUNG
EINES
MURINEN
GENOMISCHEN
ATAC-KLONS
.
32
2.7.6
PRAEPARATION
VON
X-PHAGEN-DNA
.
34
2.7.7
RESTRIKTIONSKARTIERUNG
DES
GENOMISCHEN
ATAC-KLONS
.
35
2.7.8
HERSTELLUNG
UNIDIREKTIONALER
DELETIONEN
.
35
2.7.9
PRAEPARATION
EINZELSTRAENGIGER
DNA
.
36
2.7.10
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.
37
2.7.11
PRAEPARATION
GENOMISCHER
DNA
AUS
ES-ZELLKLONEN
UND
GEWEBE
.
37
2.7.12
SOUTHEM-BLOT
.
38
2.7.13
HYBRIDISIERUNG
VON
SOUTHEM-BLOTS
.
38
2.7.14
HYBRIDISIERUNG
MIT
OLIGONUKLEOTIDEN
.
39
2.7.15
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
.
40
2
INHALTSVERZEICHNIS
2.8
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
41
2.8.1
EXPRESSION
REKOMBINANTER
ATAC
PROTEINE
IN
E.
COLI
.
41
2.8.2
EXPRESSION
IM
QUANTITATIVEN
MASSSTAB
UND
AFFINITAETSREINIGUNG
REKOMBINANTER
PROTEINE
.
41
2.8.3
TEV-SPALTUNG
.
42
2.8.4
GENERIERUNG
EINES
ATAC-SPEZIFISCHEN
ANTISERUMS
.
42
2.8.5
IMMUNPRAEZIPITATION
.
43
2.8.6
DISKONTINUIERLICHE
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
44
2.8.7
IMMUNOBLOT-ANALYSE
(WESTERN-BLOT)
.
44
2.8.8
ANALYSE
DER
GLYKOSTRUKTUR
DES
ATAC-PROTEINS
.
45
2.8.9
METABOLISCHE
MARKIERUNG
VON
PROTEINEN
(PULSE-CHASE-EXPERIMENT)
.
46
2.8.10
AUFREINIGUNG
DES
NATUERLICHEN
ATAC
PROTEINS
.
.
'
.
.
46
2.9
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
.
47
2.9.1
ISOLIERUNG
VON
T-LYMPHOZYTEN
AUS
DEM
BLUT
.
47
2.9.2
IN
VIRRO-STIMULATION
VON
T-ZELLEN
.
47
2.9.3
EXPRESSION
VON
ATAC
IN
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
48
2.9.4
MESSUNG
DER
CHEMOTAKTISCHEN
AKTIVITAET
.
48
2.9.5
MESSUNG
DES
CA
2+
-INFLUX
.
49
2.9.6
KULTUR
VON
MURINEN
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
(ES-ZELLEN)
.
50
2.9.7
TRANSFEKTION
UND
SELEKTION
VON
ES-ZELLEN
.
51
2.10
TIEREXPERIMENTELLE
METHODEN
.
52
2.10.1
PRAEPARATION,
INJEKTION
UND
TRANSPLANTATION
VON
BLASTOZYSTEN
.
52
3.
ERGEBNISSE
.
55
3.1
FUNKTIONELLE
UNTERSUCHUNG
DES
ATAC-PROTEINS
IN
VITRO
.
55
3.1.1
EXPRESSION
VON
ATAC-PROTEINVARIANTEN
IN
.
COLI
.
55
3.1.2
CHEMOTAKTISCHE
AKTIVITAET
UND
CA
2+
-MOBILISIERUNG
.
57
3.2
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DES
NATUERLICHEN
ATAC-PROTEINS
.
61
3.2.1
ATAC
-
EIN
SEZEMIERTES
PROTEIN
.
61
3.2.2
AUFREINIGUNG
DES
NATUERLICHEN
ATAC-PROTEINS
.
63
3.2.3
POSTTRANSLATIONALE
MODIFIKATIONEN
DES
NATUERLICHEN
ATAC-PROTEINS
.
67
3.3
GENERIERUNG
EINER
ATAC-DEFIZIENTEN
MAUS
.
71
3.3.1
UNTERSUCHUNG
DER
GENOMISCHEN
STRUKTUR
DES
MURINEN
ATAC-GENS
.
71
3.3.2
KONSTRUKTION
EINES
VEKTORS
ZUR
GEZIELTEN
INAKTIVIERUNG
DES
MURINEN
ATAC-GENS
.
76
3.3.3
GENERIERUNG
UND
ANALYSE
HETEROZYGOT
ATAC-DEFIZIENTER
ES-ZELLKLONE
.
78
3.3.4
GENERIERUNG
UND
ZUCHT
ATAC-DEFIZIENTER
MAEUSE
.
83
3.3.5
INITIALE
CHARAKTERISIERUNG
DER
ATAC-DEFIZIENTEN
MAEUSE
.
85
INHALTSVERZEICHNIS
3
4.
DISKUSSION
.
87
4.1
FUNKTIONELLE
UNTERSUCHUNG
DES
ATAC-PROTEINS
IN
VITRO
.
87
4.2
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DES
NATUERLICHEN
ATAC-PROTEINS
.
91
4.3
GENOMISCHE
STRUKTUR
DES
MURINEN
ATAC-GENS
.
95
4.4
PERSPEKTIVEN
.
98
5.
ZUSAMMENFASSUNG
/
SUMMARY
.
101
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
103
DANKSAGUNG
.
124
PUBLIKATIONEN
.
125
LEBENSLAUF
.
127 |
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