Aufbau einer gekoppelten Reverse Transkription / Polymerase Kettenreaktion für den Nachweis der Boten-Ribonukleinsäure des "Multidrug-Resistance-Gens" mdr1:
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1. AUFGABENSTELLUNG UND EINLEITUNG 1
1.1. MUHIDRUG RESISTANCE - EIN PROBLEM IN DER MALIGNOMTHERAPIE . 1
1.1.1. DER MDR-PHAENOTYP ALS SUMME MEHRERER MECHANISMEN 1
1.1.2 DIE ROLLE DES GLYKOPROTEINS P-GP IN DER MDR 4
11.2.1. DIE STRUKTUR DES P-GLYKOPROTEINS 4
1.1.2.2. DIE PHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG DES P-GLYKOPROTEINS 6
1.1.2.3. INHIBITOREN DES P-GLYKOPROTEINS ALS KOMPONENTEN IN DER
CHEMOTHERAPIE 7
1.1.2.4. SUBSTANZEN, WELCHE DIE EXPRESSION DES P-GLYKOPROTEINS
HERVORRUFEN 7
11.2.5. DIE GENTECHNISCHE UEBERTRAGUNG DER MDR, DAS
"TRANSGENIC-MOUSE"-MODELL 8
1,1.3. PRIMAERE UND SEKUNDAERE RESISTENZEN BEI TUMOREN ' 9
1.2. DER QUANTITATIVE NACHWEIS DER MDR 1 -MRN A ALS PROGNOSTISCHER
MARKER 10
DER MDR
1.2.1. DIE POLYMERASE KETTENREAKTION ALS METHODE ZUR AMPLIFIZIERUNG 11
KLEINSTER MENGEN AN NUKLEINSAEUREN
1.2.11. GRUNDLAGEN DER POLYMERASE KETTENREAKTION 11
1.2.2. DIE KOMPONENTEN DES PCR-SYSTEMS 15
1.2.21. DIE ZIEL-DNA (TEMPLATE) 15
1.2.2.2. NUKLEOTIDE ALS SUBSTRATE IN DER PCR 15
1.2 2.3. REAKTIONSPUFFER, SALZE, DETERGENZIEN 16
1.2.2.4. DNA-POLYMERASEN 16
1.2.2.5. PRIMER UND PRIMERDESIGN 18
1.2.2.6. DIE REVERSE TRANSKRIPTION ALS VORAUSSETZUNG FUER DIE VERWENDUNG
19
VON RNA IN DER PCR
1.3. SPEZIELLE TECHNIKEN IN DER PCR 21
13.1. "HOT START"-PCR 21
1.3.2. "MULTIPLEX"-PCR 21
1.3.3. DIE GEKOPPELTE RT/PCR 21
1.4. DIE QUANTIFIZIERUNG VON PCR-PRODUKTEN 22
1.4.1. DIE QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON DNA IN DER PCR 22
1 4.2. DIE KINETIK DER PCR - ERMITTLUNG DER EXPONENTIELLEN PHASE ALS 23
VORAUSSETZUNG FUER DIE BESTIMMUNG DER AMPLIFIKATMENGE
14.3. DIE QUANTITATIVE RT/PCR MIT EINEM RNA-STANDARD 25
15 EXPERIMENTELLE AUFGABENSTELLUNG 26
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2. MATERIAL UND METHODEN 28
2.1. KULTIVIERUNG DER ZELLEN 28
2.2. REINIGUNG UND BESTIMMUNG DER NUKLEINSAEUREN 28
2.2.1. DIE RNA-ISOLIERUNG 29
2.2.2. DIE ISOLIERUNG DER GENOMISCHEN DNA 29
2.2.3. DIE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG DER ISOLIEREN NUKLEINSAEUREN 30
2.3. DIE REVERSE TRANSKRIPTION MIT DER AMV REVERTASE 31
2.4. DIE POLYMERASE KETTENREAKTION MIT DER TAQ DNA POLYMERASE 31
2.5. DIE GEKOPPELTE RT/PCR MIT AMV REVERTASE UND TAQ DNA POLYMERASE 32
2.6. DIE "SINGLE TUBE"-RT/PCR MIT DER RTTH DNA POLYMERASE 33
2.6.1. DIE RT IN DER RTTH-RT/PCR 33
2 6 2. DIE PCR IN DER RTTH-RT/PCR 34
2.6.3. ZYKLENABHAENGIGE PRODUKTAKKUMULATION 34
2.6.4. ZUSATZ VON "FREMD"-RNA 35
2.7. DIE AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE 35
2.8. NATIVE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (PAGE) MIT ANSCHLIESSENDER 36
SILBERFARBUNG
2.9. DOT BLOT-HYBRIDISIERUNG 38
2.9.1 HERSTELLUNG DER DNA-SONDE 38
2.9.2. HERSTELLUNG DES DNA-DOT BLOTS 38
2.9.3. HYBRIDISIERUNG DER DNA-BLOTS MIT DER DIGOXIGENIERTEN SONDE 40
2.9.4. COLORIMETRISCHE DETEKTION MIT NBT UND X-PHOSPHAT 41
2.10. GERICHTETE MUTAGENESE UNTER EINSATZ SPEZIFISCHER PRIMERPAARE 42
2.11. RESTRIKTIONSVERDAU DER MUTIERTEN UND NATIVEN PCR-PRODUKTE 42
2.12. REAMPLIFIKATION DER AUS DER PCR GEWONNENEN DNA-AMPLIFIKATE 44
2.13. DIE KRYOKONSERVIERUNG UND REVITALISIERUNG VON ZELLEN 45
3. ERGEBNISSE 47
3.1. ERMITTLUNG DER SEQUENZ DES MDRL-MRNA-FRAGMENTES UND DES 47
DAZUGEHOERIGEN PRIMERPAARES ZUR NACHFOLGENDEN DETEKTION DER
MDRL-MRNA
3.2. RNA-ISOLIERUNG UND -AUSBEUTE 48
3 3. DIE RTTH DNA POLYMERASE IN DER RT UND DER GEKOPPELTEN RT/PCR 48
3.4. OPTIMALE EINSTELLUNG ALLER PARAMETER DER RTTH-RT/PCR 49
3.4.1, DIE BESTIMMUNG DER OPTIMALEN RNA-KONZENTRATION 49
3.4.2. DIE OPTIMIERUNG DER NUKLEOTID-KONZENTRATION 50
3.4.3. DIE OPTIMALE KONZENTRATION VON MAGNESIUMCHLORID ALS AKTIVATOR 51
DER DNA-POLYMERASEN
3.4.4. DIE OPTIMIERUNG DER PRIMERKONZENTRATION 51
3.4.5. ZYKLENABHAENGIGE PRODUKTAKKUMULATION UND ERMITTLUNG DER 53
EXPONENTIELLEN PHASE
3.4.6. UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON "FREMD"-RNA 56
3.4.7. DIE SPEZIFITAET DER PRIMER FUER DIE MDRL-MRNA 57
3.5. DER NACHWEIS DER MDRL-MRNA IN ZELLINIEN UND KLINISCHEN PROBEN 59
3.5.1. DIE VERWENDUNG KRYOKONSERVIERTER PATIENTENPROBEN 5 9
3.6. DIE GERICHTETE MUTAGENESE 61
3.6.1. DIE MUTAGENESE UNTER VERWENDUNG SPEZIELLER PRIMER 61
3.6.2. DAS EINFUEGEN VON RESTRIKTIONSSCHNITTSTELLEN IN DAS 62
MDR 1 -CDNA-FRAGMENT
3.7. UEBERPRUEFUNG DER SPEZIFITAET MUTIERTER UND NATIVER PCR-PRODUKT NACH
64
DER GERICHTETEN MUTAGENESE DURCH SPEZIFISCHE PRIMERPAARE
3.8. REAMPLIFIKATION DER AUS DER PCR GEWONNENEN AMPLIFIKATE 66
4. DISKUSSION 68
4.1. DIE ANALYSE DER MDRL-CDNA-SEQUENZ: DIE WAHL EINES FRAGMENTES 68
UND DES ZUGEHOERIGEN PRIMEIPAARES ZUR SPEZIFISCHEN DETEKTION DER
MDRL-MRNA
4.2. DIE OPTIMIERUNG DER GEKOPPELTEN RT/PCR MIT DER RTTH DNA 69
POLYMERASE ZUR AMPLIFIKATION DES MDRL-CDNA-FRAGMENTES
4.2.1. DIE VERWENDUNG DES ENZYMS RTTH DNA POLYMERASE 69
4.2.2. DIE OPTIMALE KONFIGURATION ALLER PARAMETER DER RT/PCR 69
4.2.3. DIE ERMITTLUNG DER EXPONENTIELLEN PHASE IM REAKTIONSABLAUF DER
PCR 74
4.3. DIE UEBERPRUEFUNG DER SPEZIFITAET UND STABILITAET DES REAKTIONSSYSTEMS
75
FUER DEN MDRL-MRNA-NACHWEIS
4.4. DIE GERICHTETE MUTAGENESE ZUR HERSTELLUNG EINES INTERNEN STANDARDS
76
4.5. DIE KOAMPLIFIKATION DES NATIVEN UND DES MUTIERTEN MDRL-CDNA- 77
FRAGMENTES IN DER "MULTIPLEX"-PCR UND DIE UEBERPRUEFUNG DER SPEZIFITAET
DURCH RESTRIKTIONSVERDAU
5.
ZUSAMMENFASSUNG
79 |
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