Entwicklung von durchflußzytometrischen Methoden zur Analyse der Diversität und Struktur mikrobieller Lebensgemeinschaften des Wassers:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Konstanz
Hartung-Gorre
1999
|
| Ausgabe: | 1. Aufl. |
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | V, 122 S. Ill., graph. Darst. |
| ISBN: | 3896494198 |
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INHALTSVERZEICHNIS
A.
EINLEITUNG
1
B.
MATERIAL
UND
METHODEN
5
B.L
ORGANISMEN,
ANZUCHT, ERNTE,
PROBEN
_
8
B.1.1
REFERENZORGANISMEN
8
B
.
1.2
BAKTERIENANZUCHT
_
9
B.1.3
PROBENNAHME
9
B.L
.4
VERDUENNUNGSKULTUR
_
10
B3
ZELLFIXIERUNG
_
.
10
B.2.1
PARAFORMALDEHYD-FIXIERUNG
10
B.2.2
ETHANOLFIXIERUNG
_
11
B.2.3
MEMBRANFILTRATION
FUER
DIE
IN
SITU-HYBRIDISIERUNG
11
B3
MEMBRANFILTRATION
ZUR
GESAMTZELLZAHLBESTINUNUNG
12
B.4
SONDENMARKIERUNG
MIT
PEROXIDASE
(NACH
URDEA
ET
AL.,
1988)13
B.4.1
AKTIVIERUNG
DES
OLIGONUKLEOTIDS
13
B.4.2
ABTRENNUNG
DES
MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDS
VOM
UNMARKIERTEN
OLIGONUKLEOTID
DURCH
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(PAGE)
_
14
B
S
ENTWICKLUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
FUER
DIE
16S-RRNA
VON
ESCHERICHIA
COLI
DSM
30083
T
17
B.6
IN
SITU-HYBRIDISIERUNG
MIT
FLUORESZENZMARKIERTEN OLIGONUKLEOTIDSONDEN
_
17
B.6.1
SONDENMARKIERUNG
UND
QUALITAETSKONTROLLE
17
B.6.2
CHARAKTERISTIKA
DER
EINGESETZTEN
SONDEN
18
B.6.3
HYBRIDISIERUNG
AUF
OBJEKTRAGEM
19
B.6.4
HYBRIDISIERUNG
AUF
POLYCARBONATFIITEM
22
B.6.5
HYBRIDISIERUNG
IN
SUSPENSION
FUER
DIE
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
22
B.6.6
HYBRIDISIERUNG
MIT
PEROXIDASE-(POD)-MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
AUF
POLYCARBONATFIITEM
_
23
B.6.7
DETEKTION
MIT
TSA-AMPLIFIKATIONSKIT
_
_24
B.6.8
AUSWERTUNG
MIT
DEM
EPIFLUORESZENZMIKROSKOP
25
B.7
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
26
B.7.1
BEGRIFFSERKLAERUNG
26
B.7.2
ALLGEMEINE
FUNKTIONSWEISE
EINES
DURCHFLUSSZYTOMETERS
26
B.7.2.1
HYDRODYNAMISCHE
FOKUSSIERUNG
26
B.7.2.2
LICHTQUELLE
27
B.7.2.3
PARAMETER
27
B.7.2.4
AUFNAHME
DER
LICHTSIGNALE
_
29
B.7.2.
5
SORTIERUNG
_
29
B.7.
3
GERAET
UND
MATERIAL
30
B.7.
3.1
HYDRAULIK
30
B.7
.3.2
LASER
31
B.7.3.3
FARBSTOFFE
32
B.7.3.4
OPTIK
32
B.7.
3.5
JUSTIERUNG
_
_
.
-
33
B.7.
3.6
TYPISCHE
MESSKONFIGURATIONEN
_
34
B.7.
3.7
ANALYSE
34
B.7.4
QUANTIFIZIERUNG
DER
SONDENFLUORESZENZ
IM
DURCHFLUSSZYTOMETER
.
35
B.7.
5
BESTIMMUNG
RELATIVER
HAEUFIGKEITEN
36
B.7.
6
BESTIMMUNG
DER
GESAMTKEIMZAHL
_
36
B.7.7
SORTIEREN
36
B.7.7.1
JUSTIERUNG
36
B.7.7.2
SORTIEREN
AUS
UMWELTPROBEN
37
B.8
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
MIT
GANZEN,
FIXIERTEN
ZELLEN
_
37
B.8.1
WASCHEN
DER
ZELLEN
_
37
B.8.2
LOSUNGEN
38
B.8.3
PRIMER
38
B.8.4
REAKTIONSANSATZ
_
39
B
.
8.5
PCR-PROGRAMM
_
39
B.8.6
QUALITATIVE
ANALYSE
DER
PCR-AMPLIFIKATE
_
40
B.8.
7
REINIGUNG
DER
PCR-AMPLIFIKATE
_
41
B.9
TRANSFER
VON
DNA
AUF
NYLONMEMBRANEN
MITTELS
DOT-BLOT-VERFAHREN
_
42
B.10
MEMBRANHYBRIDISIERUNG
MIT
POD-MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
42
B.10.1
HYBRIDISIERUNG
_
42
B.10.2
DETEKTION
DER
POD-MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDE
_
44
B.10.3
REHYBRIDISIERUNG
DER
MEMBRAN
_
44
B.LL
DNA-SCHNELLISOLIERUNG
_
45
B.12
KLONIERUNG
_
46
B.12.1
T-VEKTOR-LIGATION
_
46
B.12.2
ELEKTROPORATION
_
47
B.13
PLASMIDISOLIERUNG
UND
RESTRIKTIONSANALYSE
49
B.13.1
KOCH-STET-SCHNELLTEST
49
B.
13.2
RESTRIKTIONSANALYSE
50
B.14
NICHT
RADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG
VON
16S-RDNA
FRAGMENTEN
IN
EINEM
AUTOMATISCHEN
SEQUENZER
51
C.
ERGEBNISSSE
53
C.L
DURCHFIUSSZYTOMETRISCHE
SORTIERUNG
VON
MIKROORGANISMEN
FUER
NACHFOLGENDE
MOLEKULARBIOLOGISCHE
ANALYSEN
_
53
C.1.1
SORTIERUNG
VON
BAKTERIEN
AUS
BELEBTSCHLAMM
NACH
HYBRIDISIERUNG
MIT
FIUORESCEINMARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
53
C.1.2
DURCHFIUSSZYTOMETRISCHE
ANALYSE
VON
SORTIERTEN
ZELLEN
_
56
C.L.
3
MEHRMALIGES
SORTIEREN
57
C.1.4
PCR
AMPLIFIKATION
DER
16S-RDNA
AUS
FIXIERTEN
ZELLEN
57
C.L.
5
KLONIERUNG
EINES
PCR-PRODUKTS
AUS
LDI23A-SORTIERTEN
ZELLEN
58
C.
1.6
SEQUENZIERUNG
59
C.L.
7
SORTIERUNG
EINES
AUFFAELLIG
GROSSEN
SPIRILLUMS
AUS
BELEBTSCHLAMM
_
59
C.2
ANALYSE
DER
IN
SITU-ZUGAENGLICHKEIT
VON ESCHERICHIA
COLI
16S-RRNA
FUER
FLUORESZENZMARKIERTE
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
60
C.2.1
VORVERSUCHE
ZUR
OPTIMIERUNG
DER
HYBRIDISIERUNGSPROZEDUR
61
C.2
.1.1
SONDENKONZENTRATION
61
C.2.
1.2
ZELLEN
61
C.2.
1.3
LAGERUNG
62
C.2.2
EINFLUSS
SONDENSPEZIFISCHER
UNTERSCHIEDE
IN
DER
DISSOZIATIONSTEMPERATUR
(TA)
AUF
DIE
SONDENVERMITTELTE
FLUORESZENZ
_
62
C.2.3
OPERONDIVERSITAET
64
C.2.4
ZUGAENGLICHKEIT
DER
16S-RRNA
FUER
FLUORESZENZMARKIERTE
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
64
C.2.
5
FEINKARTIERUNG
DER
IN
RITO-ZUGAENGLICHKEIT
DER
HELICES
6
UND
18
67
C.2.6
FEINKARTIERUNG
DER
IN
RIM-ZUGAENGLICHKEIT
DER
POSITIONEN
621-693
68
C.3
DURCHFIUSSZYTOMETRISCHE ANALYSE
VON
MIKROBIELLEN
POPULATIONEN
IN
AQUATISCHEN
OEKOSYSTEMEN:
ENTWICKLUNG
UND
ANWENDUNG
NEUER
METHODEN
69
C.3.1
QUANTIFIZIERUNG
PHYLOGENETISCHER
GRUPPEN
IN
WASSERPROBEN
NACH
HYBRIDISIERUNG
_
69
C.3.
1.1
RESUSPENDIERUNG
DER
ZELLEN
69
C.3.1.2
VERGLEICHENDE
QUANTIFIZIERUNG
VON
WASSERPROBEN
MIT
MIKROSKOPIE
UND
DURCHFLUSSZYTOMETRIE70
N
C.3.2
ERHOEHUNG
DER
SENSITIVITAET
DER
IN
SIRU-HYBRIDISIERUNG
DURCH
KOMBINATION
VON
PEROXIDASEMARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
UND
TYRAMID-SIGNALAMPLIFIKATION
71
C.3.2.
1
HYBRIDISIERUNG
MIT
PEROXIDASEMARKIERTEN
SONDEN
UND
TYRAMID-SIGNALAMPLIFIKATION
IN
SUSPENSION
72
C.3.2.2
HYBRIDISIERUNG
MIT
PEROXIDASEMARKIERTEN
SONDEN
UND
TYRAMID-SIGNALAMPLIFIKATION
AUF
FILTERN
73
C.3.3
HYBRIDISIERUNG
MIT
ALEXA
-
MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
75
C.3.4
ANALYSE
EINER
MARINEN
VERDUENNUNGSKULTUR
_
77
C.3.4.1
BESTIMMUNG
DER
GESAMTKEIMZAHL
_
77
C.3.4.2
SORTIEREN
VON
BAKTERIEN
NACH
ZELLGROESSE
UND
DAPI-FLUORESZENZ
UND
ANSCHLIESSENDE
HYBRIDISIERUNG
MIT
GRUPPENSPEZIFISCHEN
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
78
CA
ERHOEHUNG
DER
GERAETESENSITIVITAET
BEIM
FACSTAR
PLUS
80
C.4.1
DAPI-FLUORESZENZ
ALS
SYSTEMSCHWELLENWERT
80
C.4.2
VERWENDUNG
VON
HOCHWERTIGEN
OPTISCHEN
FILTERN
81
C.4.3
MACRO-SORT-KOPF
_
82
D.
DISKUSSION
84
D.L
SORTIEREN
VON
DEFINIERTEN
ZELLPOPULATIONEN
MITTELS
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
84
D.1.1
DIE
BASIS
EINER
SORTIERENTSCHEIDUNG
_
84
D.1.2
ANREICHERUNGSFAKTOR
UND
REINHEIT
DER
ZELLEN
86
D.L.
3
MOLEKULARE
ANALYSE
VON
SORTIERTEN
ZELLEN
87
D.L.
4
EINSCHRAENKUNGEN
88
DJ
ZUGAENGLICHKEIT
DER
16S-RRNA
FUER
FLUORESZENZMARKIERTE
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
88
D.2.1
VORBEDINGUNGEN
89
D.2.2
ZUGAENGLICHKEIT
VERSUS
SEKUNDAERSTRUKTUR
_
90
D.2.3
ZUGAENGLICHKEIT
VERSUS
KONSERVIERTHEIT
91
D.2.3.
1
HELIX
18
92
D.2.3.
2
HELIX
6
93
D.2.3.3
HELIX
22
94
D.2.3.4
HELIX
30
94
D.2.3.5
HELIX
23
94
D3
ANWENDUNG DURCHFLUSSZYTOMETRISCHER
METHODEN
IM KONTEXT
OEKOLOGISCHER
STUDIEN
-
CHANCEN
UND
GRENZEN
96
D.3.1
POPULATIONSANALYSE
VON
NATUERLICHEN
WASSERPROBEN
IM
DURCHFLUSSZYTOMETER
96
D.3.1.1
WAHL
DER
METHODE
_
96
D.3.1.2
VERGLEICH
MIKROSKOPIE
-
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
97
D.3.1.
3
SIGNALAMPLIFIKATION
_
98
D.3.1.4
NEUENTWICKELTE
FLUORESZENZFARBSTOFFE
100
D.3.2
EINSCHRAENKUNGEN
IN
DER
SENSITIVITAET
DES
FACSTAR
PLUS
_
101
D.3.2.1
STAND
DER
TECHNIK
_
101
D.3.2.2
ZUKUENFTIGE
ENTWICKLUNGEN
102
D.3.3
SORTIEREN
NACH
PHYSIOLOGISCHEN
PARAMETERN
103
E.
ZUSAMMENFASSUNG
106
F.
ANHANG
107
G.
LITERATURVERZEICHNIS
114
III |
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| author | Fuchs, Bernhard Maximilian |
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