Retrotransposition von rekombinanten endogenen und exogenen Retroviren in kultivierten Säugerzellen:
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1. RETROELEMENTE 1
1.2. RETROVIREN 2
1.2.1. GENOM UND STRUKTUR VON RETROVIREN 2
1.2.2. EXOGENE RETROVIREN 3
1.2.3. ENDOGENE RETROVIREN 3
1.3. RETROTRANSPOSITION VON RETROVIREN 5
1.4. ZIELSETZUNG 6
2. MATERIAL UND METHODEN 7
2.1. REAGENZIEN 7
2.2. STANDARDLOESUNGEN, PUFFER UND MEDIEN 8
2.3. MATERIALIEN UND METHODEN DER MOLEKULARBIOLOGIE 9
2.3.1. VERWENDETE VEKTOREN 9
2.3.2. ANZUCHT VON ESCHERICHIA COLI 9
2.3.3. TRANSFORMATION 9
2.3.4. PLASMIDPRAEPARATIONEN AUS BAKTERIEN 10
2.3.5. ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS EUKARVOTISCHEN /.EILEN 11
2.3.6. BESTIMMUNG DER KONZENTRATION UND REINHEIT DER NUKLEINSAEUREN 11
2.3.7. AGAROSEGELELEKTROPHORESE 11
2.3.8. DNA-AUFREINIGUNG 12
2.3.9. ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON DNA 12
2.3.10. OLIGONUKLEOTIDE 13
2.3.11. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 16
2.3.12. SEQUENZIERUNG VON DNA 18
2.3.13. HERSTELLUNG EINER DNA-SONDE 18
2.3.14. SOUTHEM-BLOT 19
2.3.15. HYBRIDISIERUNG VON DNA 19
2.4. MATERIALIEN UND METHODEN DER ZELLKULTUR 20
2.4.1. ZELLLINIEN UND MEDIEN 20
2.4.2. I RANSFEKTION 20
2.4.3. SELEKTION VON TRANSFI/.IERTEN ZELLEN UEBER DAS HYGROMYCIN ODER
NEOMYCIN-RESISLENZGEN 22
2.5. IMMUNHISTOCHEMISCHE METHODE 22
2.6. PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 23
2.6.1. I .YSE EUKARYOTISCHER ZELLEN 23
2.6.2. SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE)
23
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.6.3. WCSTEM-BLOT UND HCL .-NACHWEIS 23
3. EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE 25
3.1. DAS EXPERIMENTELLE PRINZIP DER VORLIEGENDEN ARBEIT 25
3.2. KLONIERUNGEN 26
3.2.1. DIE KLONIERUNGSSTRATEGIEN 26
3.2.2. KONSTRUKTION DER REKOMHINANTEN PLASMIDE 27
3.2.3. VERWENDETE PLASMIDE FUER TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE 36
3.3. EXPRESSION VON HERV-K UND MOMLV IN SAEUGERZELLEN 37
.3.3.1. TRANSIENTE HXPRESSION VON HHRV-K-VEKTOREN UND MOML.V-VCKTOR
IN COS-7 UND HEL .A ZELLEN 37
3.3.2. STABILE HXPRESSION VON HHRV-K-VEKTOREN UND MOML.V-VCKTOR
IN HELA UND D-17 ZELLEN .38
3.3.3. WESTERN-BLOT-ANALYSE DER STABILEN KLONE VON HERV-K-VEKTOREN 41
3.4. RETROTRANSPOSITIONSEXPERIMENTE 42
3.4.1. DIE STRATEGIEN DER RETROTRANSPOSITION 42
3.4.2. STABILE KOLONIEN UND RETROTRANSPOSILIONSFREQUENZ DES MOMLV UND
HHRV-K 42
3.4.3. GENOMISCHE SOUTHEM-BLOT-ANALYSEN DERG418'- UND HYG'-KLONE 44
3.4.4. NACHWEIS DES GESPLEISSTEN UND UNGESPLEISSTEN INDIKATORGENS 47
3.4.5. NACHWEIS DER EPISOINALEN ZIRKULAEREN CDNA IN G4!8
R KLONEN 50
3.4.6. NACHWEIS DER RETROTRANSPONIERTEN INDIKATORGENE 50
3.4.7 NACHWEIS DER KOPPLUNG DES RETROTRANSPONIERTEN INDIKATORGENS MIT
VIRUSSEQUEN/EN
IN MOMI.V UND HHRV-K KLONEN 52
4. DISKUSSION 53
4.1. EXPRESSION VON HERV-K IN SAEUGERZELLEN 53
4.2. HUNDEZELLEN ALS GEEIGNETES MODELLSYSTEM FUER DIE
RETROTRANSPOSITIONSEREIGNISSE 54
4.3. RETROTRANSPOSITIONSEXPERIMENTE 54
4.4. RETROTRANSPOSITION DER INDIKATORGENE IN G418
R-KLONEN
DURCH MOMLV UND HERV-K 55
4.5. BEDEUTUNG DER EPISOMALEN ZIRKULAEREN CDNA 55
4.6. KOPPLUNG DER RETROTRANSPONIERTEN INDIKATORGENE 56
4.7. UNABHAENGIGKEIT DES RETROTRANSPOSITIONSVORGANGS VOM SELEKTIONSDRUCK
57
4.8. BERECHNUNG DER RETROTRANSPOSITIONSFREQUENZ 57
4.9. PSEUDOGEN 60
5. ZUSAMMENFASSUNG 61
6. LITERATURVERZEICHNIS 62
7. DANKSAGUNG |
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