Klonierung und Charakterisierung von Monosaccharidtransportern aus der Xylose-verwertenden Hefe Pichia stipitis:
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INHALTSVERZEICHNIS:
1 EINLEITUNG.1
1.1 XYLOSEVERWERTUNG DURCH MIKROORGANISMEN.2
1.2 XYLOSEVERWERTUNG DURCH REKOMBINANTE
S. CEREVISIAE STAEMME.7
1.3 ZUCKERTRANSPORTER.8
1.3.1 ZUCKERTRANSPORT IN HEFEN.9
1.3.1.1 MONOSACCHARIDTRANSPORTER IN
S. CEREVISIAE.7.10
1.3.1.2 MONOSACCHARIDTRANSPORT IN P. STIPITIS.10
1.4 ZIELE DER ARBEIT.11
2 MATERIAL UND METHODEN.13
2.1 MATERIAL.13
2.1.1 CHEMIKALIEN.13
2.1.2 ENZYME.13
2.1.3 SONSTIGES.13
2.1.4 STAEMME.14
2.1.4.1 E. COLI STAMM UND NAEHRMEDIUM.14
2.1.4.2 HEFESTAEMME UND NAEHRMEDIEN.14
2.1.5 PLASMIDE.15
2.1.6 PLASMIDKONSTRUKTIONEN.16
2.1.7 OLIGONUKLEOTIDE.19
2.1.8 ANTIKOERPER.20
2.2 METHODEN.20
2.2.1 TRANSFORMATION VON
E. COLI.20
2.2.2 TRANSFORMATION VON S. CEREVISIAE.20
2.2.3 TRANSFORMATION VON P. STIPITIS.20
2.2.4 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI.21
2.2.5 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS HEFE.21
2.2.6 PRAEPARATION VON GESAMT-DNA AUS E. COLI.21
2.2.7 PRAEPARATION VON GESAMT-DNA AUS S. CEREVISIAE UND P. STIPITIS.21
2.2.8 PRAEPARATION VON GESAMT-RNA AUS S. CEREVISIAE UND P. STIPITIS.21
2.2.9 BESTIMMUNG DER NUKLEINSAEUREKONZENTRATION.21
2.2.10 DNA-RESTRIKTION.21
2.2.11 DNA-LIGATION.22
2.2.12 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-5'-ENDEN.22
2.2.13 AUFFULLEN ZURUECKLIEGENDER 3'-DNA-ENDEN.22
2.2.14 UNIDIREKTIONALE EXONUKLEASELLL/NUKLEASE S1-DELETIONEN.22
2.2.15 GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA-MOLEKUELEN.22
2.2.16 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN.22
2.2.17 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN DURCH "RANDOM PRIMED
LABELING".22
2.2.18 NICHT-RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN.23
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.2.19 IDENTIFIZIERUNG SPEZIFISCHER DNA-SEQUENZEN.23
2.2.19.1 SOUTHEMANALYSE.23
2.2.19.2
E. CO/I-KOLONIEHYBRIDISIERUNG.23
2.2.20 NORTHEMANALYSE, SPEZIFISCHER NACHWEIS VON RNA-FRAGMENTEN.23
2.2.21 DNA-SEQUENZIERUNG.24
2.2.22 PCR-AMPLIFIZIERUNG VON DNA.24
2.2.23 HERSTELLUNG VON PROTEINEXTRAKTEN AUS HEFE.24
2.2.23.1 PROTEINEXTRAKTE FUER DIE MESSUNG DER SS-GALAKTOSIDASE
AKTIVITAET.24
2.2.23.2 PROTEINEXTRAKTE FUER WESTEMANALYSEN.25
2.2.23.3 ANREICHERUNG VON HIS^-MARKIERTEN SUT PROTEINEN IN
PROTEINEXTRAKTEN FUER
WESTEMANALYSEN.25
2.2.24 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION.25
2.2.25 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER SS-GALAKTOSIDASE AKTIVITAET IN
HEFE-ROHEXTRAKTEN.25
2.2.26 QUALITATIVE BESTIMMUNG DER SS-GALAKTOSIDASE AKTIVITAET.26
2.2.27 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON PROTEINEN IN
SDS-POLYACRYLAMIDGELEN.26
2.2.28 IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS VON PROTEINEN DURCH WESTEMANALYSE.26
2.2.28.1 OPTIMIERUNGEN ZUR DETEKTION HIS^-MARKIERTER SUT PROTEINE IN
WESTEMANALYSEN.27
2.2.29 SELEKTION AUF VERLUST DER URA3 FUNKTION IN P. STIPITIS.27
2.2.30 SEMI-ANAEROBE ANZUCHT VON HEFEN.27
2.2.31 MESSUNG DER ZUCKERAUFNAHME IN S. CEREVISIAE UND IN P.
STIPITITS.27
3 ERGEBNISSE.29
3.1 IDENTIFIZIERUNG UND KLONIERUNG VON ZUCKERTRANSPORTERGENEN AUS DER
HEFE
P. STIPITIS.29
3.1.1 IDENTIFIZIERUNG VON HXT-AEHNLICHEN SEQUENZEN IN P. STIPITIS DURCH
GENOMISCHE
SOUTHEMANALYSE.30
3.1.2 HERSTELLUNG EINER
P. STIPITIS GENBANK.31
3.1.3 KLONIERUNG DES SUT1 GENS AUS P. STIPITIS.31
3.1.4 SEQUENZIEMNG DES P. STIPITIS SUT1 GENS.33
3.1.5 SOUTHEMANALYSE GENOMISCHER DNA VON P. STIPITIS.35
3.1.6 KLONIERUNG DES SUT2 GENS VON P. STIPITIS DURCH
KOLONIEHYBRIDISIERUNG.36
3.1.7 SEQUENZIEMNG DES SUT2 GENS AUS P. STIPITIS.37
3.1.8 KLONIERUNG DES SUT3 GENS AUS EINER PARTIELLEN P. STIPITIS
GENBANK.39
3.1.9 SEQUENZIEMNG DES SUT3 GENS AUS P. STIPITIS.40
3.1.10 SOUTHEMANALYSEN MIT DEM XYLOSESYMPORTERGEN XYLE AUS E. COLI ALS
SONDE.42
3.1.11 VERGLEICHENDE ANALYSE DER DURCH DIE SUT GENE KODIERTEN
PROTEINSEQUENZEN.42
3.2 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DER P. STIPITIS GENE SUT1, SUT2 UND
SUT3.44
3.2.1 HETEROLOGE EXPRESSION DER P. STIPITIS SUT GENE IN S. CEREVISIAE.45
3.2.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR EXPRESSION DER GENE
SUT1, SUT2 UND SUT3 IN S. CEREVISIAE.45
3.2.3 KINETISCHE CHARAKTERISIERUNG DER SUT TRANSPORTER DURCH
ZUCKERAUFNAHMEMESSUNGEN.48
3.2.3.1 OPTIMIERUNG DER ZUCKERAUFNAHMEMESSUNGEN.48
3.2.3.2 GLUKOSEAUFNAHMEMESSUNGEN IN
S. CEREVISIAE TRANSFORMANTEN.49
3.2.3.3 XYLOSEAUFNAHMEMESSUNGEN IN S. CEREVISIAE TRANSFORMANTEN.51
3.2.3.4 BESTIMMUNG DES SUBSTRATSPEKTMMS DER SUT TRANSPORTER.53
3.2.3.5 KOMPETITIONSEXPERIMENTE.55
3.3 ANALYSEN ZUR FUNKTION DER SUT GENE IN P. STIPITIS.57
3.3.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR EXPRESSION DER
SUT GENE IN P. STIPITIS.57
3.3.1.1 EXPRESSIONSANALYSEN DURCH SUT-PROMOTOR-/ACZ-FUSIONEN.57
3.3.1.2 WESTERNANALYSE ZUR SS-GALAKTOSIDASE EXPRESSION IN
P. STIPITIS.58
3.3.1.3 NORTHEMANALYSE ZUR LACZ EXPRESSION IN P. STIPITIS.59
3.3.1.4 UNTERSUCHUNG ZUR EXPRESSION DER SUT GENE IN P. STIPITIS DURCH
NORTHEMANALYSEN. 60
3.3.1.5 KONSTRUKTION HIS6-MARKIERTER SUT PROTEINE UND DEREN EXPRESSION
IN P. STIPITIS.62
3.4 VERSUCHE ZUR KONSTRUKTION EINER SUT NULLMUTANTE IN P. STIPITIS.64
3.4.1 VERSUCHE ZUR ISOLIERUNG VON SELEKTIONSMARKEN IN
P. STIPITIS.65
3.4.2 DISRUPTION DES SUT1 GENS IN P. STIPITIS.67
3.4.2.1 VERSUCHE ZUR DISRUPTION DES SUT1 GENS DURCH
EINSCHRITT-GENDISRUPTION.67
3.4.2.2 DISRUPTION DES SUT1 GENS DURCH INTERNE FRAGMENT-DISRUPTION MIT
EINEM INTEGRATIVEN
VEKTOR.69
3.5 CHARAKTERISIERUNG DES GLUKOSE- UND XYLOSETRANSPORTSYSTEMS IN
P. STIPITIS.72
3.5.1 BESTIMMUNG DER GLUKOSEAUFNAHMEKINETIK DER
P. STIPITIS STAEMME CBS5774 UND PTW101
NACH WACHSTUM UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN.73
3.5.2 BESTIMMUNG DER GLUKOSEAUFNAHME IN DEM P. STIPITIS WILDTYPSTAMM UND
DER
SUTL DISRUPTANTE NACH WACHSTUM UNTER ANAEROBEN BEDINGUNGEN.75
3.5.3 XYLOSEAUFNAHMEMESSUNGEN MIT AEROB GEWACHSENEN P. STIPITIS
KULTUREN.77
3.5.4 XYLOSEAUFNAHMEMESSUNGEN MIT ANAEROB GEWACHSENEN P. STIPITIS
STAEMMEN.79
3.5.5 KOMPETITIONSEXPERIMENTE ZUR ZUCKERAUFNAHME IN P. STIPITIS.80
4 DISKUSSION.83
4.1 ZUCKERTRANSPORTERGENE IN P. STIPITIS.84
4.2 SEQUENZANALYSE DER SUT PROTEINE UND VERGLEICH MIT TRANSPORTERN
ANDERER ORGANISMEN.85
4.3 CHARAKTERISIERUNG DER SUT TRANSPORTER AUS P. STIPITIS DURCH
HETEROLOGE EXPRESSION
IN S. CEREVISIAE.90
4.3.1 TRANSPORTCHARAKTERISTIKEN DES SUTL PROTEINS.91
4.3.2 EIGENSCHAFTEN DES SUT2 TRANSPORTERS.92
4.3.3 EIGENSCHAFTEN DES SUT3 MONOSACCHARIDTRANSPORTERS.93
4.3.4 KRITISCHE ANALYSE DER ERGEBNISSE DER AUFNAHMEMESSUNGEN.93
4.4 REGULATION DER EXPRESSION DER SUT GENE IN P. STIPITIS.94
4.5 GEZIELTE GENDISRUPTION IN P. STIPITIS.96
4.6 EIGENSCHAFTEN DES GLUKOSE- UND XYLOSETRANSPORTES IN DER HEFE P.
STIPITIS.97
4.6.1 GLUKOSETRANSPORT IN P. STIPITIS.98
4.6.2 XYLOSETRANSPORT IN P. STIPITIS.99
4.6.3 ANALYSE DER KOMPETITIONSEXPERIMENTE.100
4.7 PERSPEKTIVEN.101
5 ZUSAMMENFASSUNG.103
6 LITERATUR VERZEICHNISS.104
7 ABKUERZUNGEN.115 |
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