Infektiösität des Hepatitis-C-Virus: Untersuchungen zu Bindungsverhalten und zellulären Rezeptoren
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Göttingen
Cuvillier
1998
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Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen
I.EINLEITUNG 1
1.1. Das Hepatitis C Virus (HCV) 1
1.2. Interaktion von Viren mit zellulären Rezeptoren 5
1.2.1. Der Iow density lipoprotein-Rezeptor (LDL-Rezeptor) 8
1.3. Ziel der Arbeit 9
2. MATERIAL 11
2.1. escherichia co1 stämme 11
2.2. zellinien 11
2.3. Lösungen und Puffer 11
2.4. nukleotide und nukleinsäuren 14
2.4.1. Nukleotide 14
2.4.2. DNA-Längenstandards 15
2.4.3. Plasmide 15
2.4.4. Oligonukleotidprimer 16
2.5. Enzyme 17
2.6. Antikörper 17
2.7. Lipoproteine 17
2.8. Zellkulturmedien 18
2.9. Chemikalien und Reagenzien 18
2.10. Seren 19
2.11. Bioinformatische Programme 19
3. METHODEN 19
3.1. Arbeiten mit RNA 19
3.1.1. RNA-Isolierung mit RNA-Clean 19
3.1.2. Isolierung von RNA mit dem High Pure Viral RNA Kit 20
3.1.3. Reverse Transkription von RNA in cDNA 20
3.1.3.1. Reverse Transkription genomischer HCV-RNA in der NCR-Region 20
3.1.3.2. Reverse Transkription genomischer HCV-RNA in der envelope-Region 20
3.1.3.3. Reverse Transkription genomischer Hepatitis G Virus-RNA 21
3.2. Arbeiten mit DNA 21
3.2.7. Polytnerase-Kettenreaktion (PCR) 21
3.2.1.1. PCR zum Nachweis von HCV-cDNA 21
3.2.1.2. Amplifikation des HCV-envelope-Bereichs 22
3.2.1.3. PCR zum Nachweis von Hepatitis G Virus-cDNA 22
3.2.2. Agarosegel-Elektrophorese 23
3.2.2.1. Analytische Agarosegel-Elektrophorese 23
Inhaltsverzeichnis
3.2.2.2. PräparativeAgarosegel-Elektrophorese 23
3.2.3. Aufreinigung von PCR-Produkten 24
3.2.4. DNA-Sequenzierung 24
3.2.4.1. Sequenzgel-Elektrophorese 25
3.2.5. Herstellung eines Digoxygenin-markierten DNA-Fragments (DIG-Sonde) mittels PCR 25
3.2.6. Direktmarkierung eines PCR-Produktes mit Alkalischer Phosphatase 26
3.2.7. Southern Blot (nach SOUTHERN, 1975) 26
3.2.7.1. DNA-Transfer auf Nitrozellulosemembran 26
3.2.7.2. DNA-Transfer auf Nylonmembran 27
3.2.7.3. Hybridisierung mit einer DIG-Sonde 27
3.2.7.4. Hybridisierung mit Alk Phos Direct 28
3.2.7.5. Detektjon von Sonden 28
3.2.8. Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen 29
3.2.9. Klonierung von PCR-Produkten 29
3.2.10. Transformation kompetenter Bakterienzellen 29
3.2.10.1. Herstellung kompetenter Bakterienzellen 29
3.2.10.2. Transformation von E. coli 30
3.2.11. Plasmid-DNA-Präparation 30
3.2.11.1. Minipräparation von Plasmid-DNA 30
3.2.11.2. Maxipräperation von Plasmid-DNA 31
3.2.12. Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 32
3.2.13. In vitro-Transkription von DNA „„32
3.3. ZELLKULTURTECHNIKEN 32
3.3.7. Subkultivieren von Zellen 33
3.3.2. Zellzahlbestimmung 33
3.3.3. Kryokonservierung von Zellen .34
3.3.4. Nachweis von Mycoplasmen 34
3.3.5. Transiente Transfektion von COS7-Zellen 35
3.3.6. Nachweis des LDL-Rezeptors auf Zellen 35
3.4. Spezielle Versuche 3g
3.4.7. Quantifizierung von Virusmengen 35
3.4.1.1. Semi-Quantifizierung durch Endpunktitration .36
3.4.1.2. Semi-Quantifizierung von HCV durch Hybridisierung 36
3.4.2. Kopräzipitation von Serumprotein-assoziierten Viren 37
3.4.3. Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation 37
3.4.4. HCV-Genotypisierung gg
3.4.5. HCV-Bindungsansätze gg
3.4.5.1. Bindungsansatz mit adhärent wachsenden Zellen ..38
3.4.5.2. Bindungsansatz in Suspensionszellkultur 39
3.4.5.3. Bindungsansatz auf semipermeablen Membranen 39
Inhaltsverzeichnis
4. ERGEBNISSE 40
4.1. VORVERSUCHE 40
4.1.1. Auswahl geeigneter Seren und Semi-Quantifizierung von HCV 40
4.1.2. Regulation des LDL-Rezeptors 41
4.2. Analyse HCV-positiver Seren 43
4.2.1. Assoziation von HCV mit LDL 43
4.2.2. Dichtegradientenzentrifugation HCV-positiver Seren 44
4.3. Adsorption von HCV an kultivierte Zellen 48
4.3.1. Bindungskapazität verschiedener Zellinien 48
4.3.2. HCV-Bindung unter LPDM-Bedingungen 50
4.3.3. Bindung von HCV an Zellen auf semipermeablen Membranen 50
4.3.4. Serielle Bindung von HCV an HepG2-Zellen 52
4.3.5. Bindungsansätze mit HCV-positiven Gradientenfraktionen 53
4.3.6. Einfluß von Saccharose auf die Bindung von HCV an HSF-Zellen 58
4.3.7. Dichtegradientenzentrifugation von Zellkulturüberständen 59
4.3.8. Inhibition der HCV-Bindung an HSF und HepG2 durch LDL 61
4.3.9. Bindung von HCV an pSVL-LDLr transfizierte COS7-Zallen 62
4.3.10. Inhibition der Bindung von HCV an HSF durch lgG-C7. 63
4.4. HCV-/N VJTRO-lNFEKTIONSVERSUCHE 64
4.4.1. In vitro-lnfektion PHA-stimulierter Molt4-Zellen 64
4.4.2. In vitro-lnfektion von HSF-Zellen mit HCV. 66
4.4.3. In vitro-Koinfektion von HSF-Zellen mit HCV und HGV 67
4.5. Analyse der HCV-envelope Region 68
4.5.1. Amplifikation von HCV-E1/E2 68
4.5.2. Klonierung und Sequenzierung der E1/E2-Ampllfikate 70
4.5.3. In vitro-Transkription 72
5. DISKUSSION 75
5.1. Nachweis und Quantifizierung von HCV 75
5.2. Analyse HCV-positiver Seren 76
5.2.1. Assoziation von HCV mit Lipoproteinen 76
5.2.2. Biologische Relevanz der HCV-Lipoprotein-Komplexe 78
5.2.3. Verteilung von HCV im Saccharose-Dichtegradienten 80
5.3. Adsorption von HCV an kultivierte Zellen 83
5.3.1. Restriktion der Virusadsorption durch zelluläre Faktoren 84
5.3.2. Restriktion der Virusadsorption durch virale Faktoren 85
5.4. Die Bedeutung des LDL-Rezeptors als HCV-Rezeptor 87
5.5. In vitro HCV-Infektionen 93
5.5.1. In vitro-lnfektionsmoaelle für HCV 93
5.5.2. Infektion PHA-stimulierter Molt4-Zellen 94
Inhaltsverzeichnis
5.5.3. Infektion von HSF-Zellen 95
5.5.4. Koinfektion mit HGV. 96
5.6. Analyse der HCV-hvvelope-Region 97
5.6.1. Defekte HCV-Genome 97
5.6.2. Defekte interferierende HCV-Partikel. 100
5.7. Ausblick 101
6. ZUSAMMENFASSUNG 103
7. LITERATURVERZEICHNIS 105
Danksagung
Lebenslauf
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