Hormonelle und antioxidative Prävention von Ischämie-Reperfusionsschäden der Leber durch atriales natriuretisches Peptid und Glutathion:
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Lengerich [u.a.]
Pabst
1998
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| Series: | Beiträge zur Transplantationsmedizin
37 |
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| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Item Description: | Zugl.: München, Univ., Habil.-Schr., 1997 |
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung l
1.1. Die klinische Bedeutung von Konservierungsschäden bei der
Lebertransplantation 1
1.2. Konservierungsschäden der Leber: Heutiger Wissensstand 4
1.2.1. Die Bedeutung von Ischämie- und Reperfusionsschäden 4
1.2.2. Zelluläre Strukturierung des Leberparenchyms 6
1.2.3. Physiologie der Leberhämodynamik 10
1.2.4. Morphologische Veränderungen während der Konservierung und
Reperfusion von Lebern 12
1.2.5. Pathomechanismen hepatischer Ischämieschäden 14
1.2.5.1. Störungen der intrazellulären Ionen-Homöostase 14
1.2.5.2. Aktivierung zellschädigender Enzyme 17
1.2.6. Pathomechanismen hepatischer Reperfusionsschäden 19
1.2.6.1. Bildung, Toxizität und Entgiftung reaktiver Sauerstoff-Spezies 19
1.2.6.2. Reperfusionsschäden der Leber durch reaktive Sauerstoff-Spezies 25
1.2.6.3. Störungen der hepatischen Mikrozirkulation 30
1.3. Maßnahmen zur Reduktion hepatischer Konservierungsschäden 35
1.3.1. Etablierte Verfahren 35
1.3.2. Neue therapeutische Ansätze 38
1.3.2.1. Ca2+-senkende Hormone 38
1.3.2.2. Endogene Antioxidantien 44
1.4. Experimentelle Modelle zur Untersuchung hepatischer Ischämie-
Reperfusionsschäden 47
2. Fragestellung 49
3. Material und Methoden 51
3.1. Experimentelle Modelle und Versuchsprotokolle 51
3.1.1. Rattenleber-Perfusion 51
3.1.2. Kontinuierliche Leberperfusion in situ 53
3.1.2.1. Perfusion unbehandelter Lebern 53
3.1.2.2. Perfusion der Lebern mit ANP, L-Arginin, L-NAME und Glutathion 53
3.1.2.3. oti-adrenerge Stimulation der perfundierten Rattenleber 54
II
Inhaltsverzeichnis
3.1.2.4. Aktivierung Kupffer scher Sternzellen in der perfundierten Leber 55
3.1.2.5. Perfusion der Leber mit reaktiven CVIntermediaten und
Myeloperoxidase-Produkten 56
3.1.2.6. Beeinflussung oxidativer Zellschäden durch ANP und 8-Br-cGMP 57
3.1.3. Modelle der Ischämie-Reperfusion 58
3.1.3.1. Normotherme Ischämie-Reperfusion der Leber 58
3.1.3.2. Hypotherme Ischämie-Reperfusion der Leber 59
3.1.3.2.1. Präischämische Behandlung der Lebern mit ANP 60
3.1.3.2.2. Präischämische Perfusion mit natriuretischen Peptiden und 8-Br-cGMP....61
3.1.3.2.3. Postischämische Behandlung der Lebern mit Antioxidantien 62
3.1.3.2.4. Prä- und postischämische Behandlung mit L-Arginin und L-NAME 63
3.1.4. Gewinnung des Plasmas zur Bestimmung der ANP-Konzentration
in der nepalischen Zirkulation der Ratte 63
3.1.5. Extrazelluläre Glutathion-Oxidation durch Granulozyten 64
3.1.5.1. Isolation menschlicher neutrophiler Granulozyten 64
3.1.5.2. Inkubation neutrophiler Granulozyten 64
3.1.6. Oxidierende Eigenschaften von hypochloriger Säure und
Chloraminen 66
3.1.6.1. Synthese von Chloraminen 66
3.1.6.2. Inkubation von GSH und GSSG mit hypochloriger Säure und
Monochloramin 67
3.2. Bestimmungen 67
3.2.1. Portaler Druck 67
3.2.2. Gallefluß 68
3.23. Zellschäden in der perfundierten Rattenleber 68
3.2.3.1. Sinusoidaler Lactat-Dehydrogenase (LDH)-Efflux 68
3.2.3.2. Sinusoidaler Purinnukleosid-Phosphorylase (PNP)-Efflux 68
3.2.3.3. Histologischer Nachweis von Zellschäden durch Perfusion der Leber mit
Trypanblau 69
3.2.4. Metabolite im Leberperfusat 70
3.2.4.1. Glucose 70
3.2.4.2. Lactat 70
3.2.4.3. Pyruvat 71
111
Inhaltsverzeichnis
3.2.4.4. Gesamt-Glutathion 71
3.2.4.5. Glutathiondisulfid (GSSG) 72
3.2.4.6. Glutathion (GSH) 73
3.2.4.7. Hepatische Sauerstoff-Aufnahme 73
3.2.4.8. Berechnung der Metabolit-Aufnahme und Effluxraten 73
3.2.4.9. Zymosan-Aufnahme als Maß der Phagozytose-Aktivität Kupffer scher
Sternzellen 73
3.2.5. Metabolite in der Galle 74
3.2.5.1. Gesamt-Glutathion 74
3.2.5.2. GSH und GSSG 74
3.2.6. Intrazelluläre Metaboliten 75
3.2.6.1. Präparation der Leberextrakte 75
3.2.6.2. Gesamt-Glutathion-Gehalt 75
3.2.6.3. ATP-Gehalt 75
3.2.6.4. ADP-und AMP-Gehalte 76
3.2.7. ANP-Konzentration im Ratten-Plasma 77
3.2.8. Rezeptor-Expression natriuretischer Peptide in der Rattenleber
sowie in parenchymalen und nicht-parenchymalen Leberzellen 78
3.2.8.1. RNA-Extraktion und mRNA-Isolierung 78
3.2.8.2. Reverse Transkription 79
3.2.8.3. Polymerase-Kettenreaktion 80
3.2.9. GSH- und GSSG-Konzentration im Inkubations-Puffer neutrophiler
Granulozyten 83
3.3. Statistik 83
3.4. Material 84
3.4.1. Chemikalien 84
3.4.2. Enzyme 87
3.4.3. Enzym-Inhibitoren und -Aktivatoren 87
3.4.4. Hormone 87
3.4.5. Rezeptor-Antagonisten 88
3.4.6. Oligonukleotide 88
3.4.7. Pufferlösungen 89
3.4.8. Verbrauchsmaterialien 90
IV
Inhaltsverzeichnis
4. Ergebnisse 91
4.1. Charakterisierung des Modells der perfundierten Rattenleber 91
4.2. Perfusion der Leber mit atrialem natriuretischem Peptid (ANP) 93
4.3. Der Einfluß von ANP auf a-adrenerge hämodynamische und
metabolische Effekte in der perfundierten Rattenleber 94
4.3.1. Modulation der Phenylephrin-induzierten Vasokonstriktion durch
ANP 94
4.3.2. Mechanismus der ANP-vermittelten Antagonisierung a-adrenerger
hämodynamischer Effekte 98
4.3.3. Konzentrationsabhängigkeit der hämodynamischen ANP-Effekte 100
4.3.4. Die Konzentration von ANP in der hepatischen Zirkulation der Ratte 102
4.4. Der Einfluß von ANP auf Ischämie-Reperfusionsschäden der
Leber nach normothenner Ischämie 104
4.4.1. Prä- und postischämische Behandlung mit ANP 105
4.4.2. Prä- oder postischämische Behandlung mit ANP 110
4.5. Der Einfluß von ANP auf hypotherme Konservierungsschäden der
Leber 112
4.5.1. Zellschäden und postischämische Leberfunktion 113
4.5.2. Parenchymale und nicht-parenchymale Zellschäden 118
4.5.3. Zirkulationsstörungen der Leber 123
4.5.4. O2-Verbrauch und intrazelluläre Adeninnukleotid-Gehalte 124
4.5.5. Intrazellulärer GSH-Gehalt und sinusoidale GSH-Ausscheidung 126
4.6. Identifizierung der verantwortlichen Signal-Transduktions-
prozesse bei der ANP-vermittelten Protektion der Leber 129
4.6.1. Nachweis der mRNAs der Rezeptoren natriuretischer Peptide in der
Leber durch PCR 129
4.6.2. Nachweis des hepatoprotektiven ANP-Rezeptors 130
4.6.3. GC-A-Rezeptorexpression in parenchymalen und nicht-parenchymalen
Zellen der Rattenleber 134
4.7. Der Einfluß von ANP auf Leberzellschäden durch aktivierte
Kupffer-Zellen 135
4.7.1. Charakterisierung hepatischer Zellschäden durch aktivierte Kupffersche
Stemzellen in der perfundierten Rattenleber 135
4.7.2. Der Einfluß von ANP auf Leberzellschäden durch aktivierte Kupffer-
Zellen 137
V
Inhaltsverzeichnis
4.7.3. Der Einfluß von ANP auf hepatische Zirkulationsstörungen durch
aktivierte Kupffer-Zellen 140
4.7.4. Beeinflussung der Phagozytose von Kupffer-Zellen durch ANP 142
4.7.5. Der Einfluß von ANP auf H2O2-induzierte Leberzellschäden 142
4.8. Charakterisierung ROS- und NOS-induzierter Reperfusions-
schäden nach hypothermer Konservierung der Leber 145
4.8.1. Der Einfluß von Superoxid-Dismutase und Katalase auf hypotherme
Ischämie-Reperfusionsschäden der Leber 145
4.8.2. Der Effekt von L-NAME und L-Arginin auf hepatische Ischämie-
Reperfusionsschäden 150
4.9. Charakterisierung Glutathion-Peroxidase-unabhängiger
antioxidativer Eigenschaften des Glutathions 154
4.9.1. Der Einfluß aktivierter Granulozyten auf extrazelluläres Glutathion 154
4.9.2. Identifizierung der GSH-verbrauchenden Oxidantien 156
4.10. Der Einfluß von Glutathion auf Reperfusionsschäden der Leber 163
4.10.1. Zellschäden und Funktion der Leber nach Konservierung in UW-
Lösung und Reperfusion mit Glutathion 164
4.10.2. Intrazelluläre Glutathion-Gehalte GSH-behandelter Lebern 171
4.10.3. Der Einfluß von Glutathion auf postischämische Zirkulationsstörungen
der Leber 172
4.11. Der Einfluß reaktiver O2-Spezies auf die hepatische Zirkulation 174
4.11.1. Hämodynamische Effekte aktivierter Kupffer-Zellen in der
perfundierten Rattenleber 174
4.11.2. Hämodynamische Effekte von O2 * und H2O2 in der Leber 178
4.11.3. Mechanismus der ROS-induzierten Vasokonstriktion 181
4.11.4. Der Einfluß von Hypochlorit und Chloraminen auf die hepatische
Zirkulation 183
5. Diskussion 185
5.1. Die Bedeutung von ANP bei der Regulation der hepatischen
Zirkulation 185
5.1.1. Modulation deraj-adrenergen Vasokonstriktion in der Leber durch
ANP 185
5.1.2. Vasorelaxierendes Potential von ANP in der Leber 187
5.1.3. Mechanismus der langanhaltenden hämodynamischen Wirkungen von
ANP in der Leber 189
VI
Inhaltsverzeichnis
5.2. Prävention hepatischer Ischämie-Reperfusionsschäden durch
ANP 192
5.2.1. Zytoprotektive Eigenschaften des ANP 192
5.2.2. Rezeptoren und second messenger der ANP-Protektion 195
5.2.3. Mechanismen der ANP-vermittelten Zytoprotektion 196
5.3. Reperfusionsschäden nach hypothermer Leberkonservierung:
Die Bedeutung der hepatischen ROS- und NOS-Produktion 206
5.4. Nicht-enzymatische Oxidation von extrazellulärem Glutathion
durch aktivierte Granulozyten 210
5.5. Prävention hepatischer Reperfusionsschäden durch Glutathion 216
5.5.1. Zytoprotektive Effekte des Glutathions 216
5.5.2. Mechanismus der Zytoprotektion durch Glutathion 218
5.6. Zirkulationsstörungen der Leber durch reaktive Ch-Spezies 223
6. Zusammenfassung 229
7. Abkürzungen 237
8. Literatur 239
8.1. Zitierte Arbeiten 239
8.2. Publizierte Ergebnisse 270
9. Danksagung 271
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