Untersuchungen des Tn10-kodierten Tet-Repressors mit monoklonalen Antikörpern:
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
ZUSAMMENFASSUNG
1
2.
EINLEITUNG
2
2.1
ANTIKOERPER
-
STRUKTUR
UND
FUNKTION
2
2.1.1
ANTIKOERPER-ANTIGEN
WECHSELWIRKUNG
4
2.1.2
EPITOPE
UND
ANTIGENITAET
6
2.1.3
EINSATZ
VON
ANTIKOERPERN
ZUR
CHARAKTERISIERUNG
VON
PROTEINEN
7
2.2
BAKTERIELLE
REGULATORPROTEINE
9
2.3
TETR
-
STRUKTUR
UND
FUNKTION
10
2.3.1
TET-OPERATOR-BINDUNG
11
2.3.2
DIMERISIERUNG
12
2.3.3
TETRAZYKLIN-BINDUNG
12
2.3.4
DER
INDUKTIONSMECHANISMUS
13
2.4
ZIELSETZUNG
14
3.
MATERIALEN
UND
METHODEN
IS
3.1.
MATERIALIEN
15
3.2
ZELLINIEN,
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE
18
3.3.
MEDIEN,
LOESUNGEN
UND
PUFFER
19
3.3.1.
NAEHRMEDIEN FUER
ZELLINIEN
19
3.3.2
BAKTERIENAEHRMEDIEN
20
3.3.3
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
20
3.3.4
MATERIALIEN
FUER
DIE
GELELEKTROPHORESE
20
3.3.5
PUFFER
FUER
CHROMATOGRAPHIEN
21
3.3.6
PUFFER
FUER
FLUORESZENZEXPERIMENTE
21
3.3.7
PUFFER
FUER
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
22
3.4.
METHODEN
23
3.4.1
ALLGEMEINE
METHODEN
23
3.4.2
METHODEN
DER
ZELLKULTUR
23
3.4.2.1
HERSTELLUNG
VON
HYBRIDOMAZELLEN
UND
HAT-SELEKTION
23
3.4.2.2
IMMUNSELEKTION
24
3.4.2.3
KULTIVIERUNG
VON
ZELLINIEN
UND
ERNTEN
VON
KULTURUEBERSTAENDEN
25
3.4.2.4
SUBKLONIERUNG
VON
HYBRIDOMAZELLEN
25
3.4.3
MODIFIZIERUNGSMETHODEN
VON
DNA
25
3.4.3.1
RESTNKTIONSSPALTUNG
VON
DNA
25
3.4.3.2
PRAEPARATION
VON
ZE/O-TRAGENDEN
FRAGMENTEN
25
3.4.3.3
HYBRIDISIERUNG
VON
KOMPLEMENTAEREN
OLIGONUKLEOTIDEN
26
3.4.3.4
GELMOBILITAETSANALYSEN
26
3.4.4
UEBEREXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
VON
TETR
26
3.4.4.1
UEBEREXPRESSION
VON
TETR
UND
METABOLISCHE
MARKIERUNG
MIT
[
"
S]
26
3.4.4.2
ZELLAUFSCHLUSS
27
3.4.4.3
SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE
AUFREINIGUNG
VON
TETR
28
3.4.5
AUFREMIGUNG
VON
MAKS
29
3.4.6
PROTEINMENGENBESTIMMUNG
30
3.4.7
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
30
3.4.7.1
BLOT
METHODEN
30
3.4.7.2
ELISA
31
INHALTSVERZEICHNIS
II
3.4.7.3
IMMUNOPRAEZIPITATION
34
3.4.8
FLUORESZENZMESSUNGEN
35
3.4.8.1
BESTIMMUNG
DER
TC-BINDEAKTIVITAET
VON
TETR
35
3.4.8.2
BESTIMMUNG
DER
ASSOZIATIONSGESCHWINDIGKEITSKONSTANTE
VON
TETR
36
3.4.8.3
ENERGIETRANSFERMESSUNGEN
36
3.4.9
RADIOAKTIVE
ARBEITEN
37
3.4.9.1
AUTORADIOGRAMME
VON
SDS-GELEN
37
3.4.9.2
SCINTILLATIONSMESSUNGEN
37
4.
ERGEBNISSE
38
4.1
VERGLEICH
DER
BINDUNG
VON
ANTI-TETR
MAKS
AN
FREIEN
UND
LIGAND
38
GEBUNDENEN
TETR
4.1.1
VORARBEITEN
ZUR
IMMUNOPRAEZIPITATION
38
4.1.1.1
PRODUKTION
UND
AUFREINIGUNG
VON
[
35
S]-MARKIERTEM
TETR
38
4.1.1.2
PRAEPARATION
VON
ZEZ-OPERATOR
FRAGMENTEN
40
4.1.2
BINDUNGSSTUDIEN
DER
MAKS
AN
TETR
DURCH
IMMUNOPRAEZIPITATION
42
4.1.3
BINDUNGSSTUDIEN
DER
MAKS
AN
TETR
DURCH
INVERSE
IMMUNOPRAEZIPITATION
43
4.1.3.1
VERGLEICH
DER
MAK
BINDUNG
AN
FREIEN
UND
INDUZIERTEN
TETR
44
4.1.3.2
ABHAENGIGKEIT
DER
TETR
BINDUNG
VON
DER
TC-KONZENTRATION
45
4.1.3.3
EFFEKT
VON
TC-DENVATEN
AUF
DIE
BINDUNG
DER
MAKS
6G7
UND
7D5
46
4.1.3.4
EINFLUSS
VON
ZEZ-OPERATOR
AUF
DIE
BINDUNG
DER
MAKS
AN
TETR
46
4.1.3.5
BINDUNG
DES
MAK
7D5
AN
TETR
S
MUTANTEN
47
4.1.3.6
BESTIMMUNG
DER
GLEICHTGEWICHTSKONSTANTE
FUER
DIE
TETR
BINDUNG
DES
MAK
7D5
49
4.2
VERFEINERUNG
DER
EPITOPKARTIERUNG
DER
ANTI-TETR
MAKS
50
4.2.1
UMKLONIERUNG
UND
UEBEREXPRESSION
VON
TETR
MUTANTEN
50
4.2.2
EPITOPKARTIERUNG
VON
ANTI-TETR
MAKS
MIT
UEBEREXPRIMIERTEN
TETR
MUTANTEN
51
4.2.3
BESTIMMUNG
ADDITIVER
INDICES
DES
MAK
6G7
52
4.3
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
MAKS GEGEN
DEN
TETR-ZEZ-OPERATOR
KOMPLEX
53
4.3.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
MAKS
TOM3
UND
TOM4
53
4.3.2
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
TOP
UND
TO
MAKS
55
4.3.2.1
IMMUNSELEKTION
DER
TOP
UND
TO
HYBNDOMAZELLINIEN
55
4.3.2.2
SUBKLONIERUNG
UND
SUBKLASSENBESTIMMUNG
VON
TOP
MAKS
56
4.3.2.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
MAK
TOP
19
56
4.3.2.4
KLASSEN
UND
SUBKLASSENBESTIMMUNG
DER
TO
ANTIKOERPER
58
4.3.2.5
UNTERSUCHUNG
DER
BINDESPEZIFITAET
VON
TO
MAKS
IN
KOMPETITIVEN
ELISA
58
4.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
BINDUNG
DES
ANTI-TETR-TC
MAK
TC
14
AN
TETR
62
4.5
EINFLUSS
VON
MAKS
AUF
TC-UND
ZE/O-BINDUNG
DURCH
TETR
63
4.5.1
EINFLUSS
VON
MAKS
AUF
DIE
BINDUNG
VON
TC
AN
TETR
64
4.5.2
EINFLUSS
DES
MAK
7D5
AUF
DIE
BINDUNG
VON
TETO
AN
TETR
65
5.
DISKUSSION
67
5.1
UNTERSUCHUNG
VON
ANTI-TETR
MAKS
67
5.1.1
ERGAENZENDE
EPITOPKARTIERUNG
DER
ANTI-TETR
MAKS
IN
WESTERN
BLOTS
67
5.1.2
BINDUNGSSTUDIEN
DER
ANTI-TETR
MAKS
DURCH
IMMUNOPRAEZIPITATION
71
5.1.3
BINDUNG
DER
ANTI-TETR
MAKS
AN
FREIEN,
INDUZIERTEN
UND
ZEZO-GEBUNDENEN
TETR
72
5.2
HERSTELLUNG
UND
UNTERSUCHUNG
VON
ANTI-TETR-ZEZO
MAKS
77
5.2.1
IMMUNISIERUNG
MIT
TETR-ZEZO
77
INHALTSVERZEICHNIS
5.2.2
5.2.3
5.2.4
5.2.4.1
5.2.4.2
VORARBEITEN
ZUR
SELEKTION
VON
MAKS
78
IMMUNSELEKTION
DER
TOP
UND
TO
MAKS
78
CHARAKTERISIERUNG
DER
AG-AK
WECHSELWIRKUNG
DER
ANTI-TETR-TERO
MAKS
80
BINDUNG
AN
NATIVEN
UND
DENATURIERTEN
TETR
80
KONFORMATIONSSPEZIFITAET
DER
ANTI-TETR
TETO
MAKS
UND
EPITOPKARTIERUNG
82
5.3
KONFORMATIONSAENDERUNGEN
DES
TETR
86
5.4
5.4.1
5.4.2
5.4.3
BINDUNGSSTUDIEN
MIT
DEN
MAKS
7D5
UND
TCL4
88
NACHWEIS
DER
KOMPLEXIERUNG
VON
TC-DERIVATEN
DURCH
DEN
MAK
TC
14
88
STRUKTURUNTERSUCHUNG
VON
TETRS
MUTANTEN
DURCH
DEN
MAK
7D5
90
EINFLUSS
DER
MAKS
7D5
UND
TCL4
AUF
DIE
AKTIVITAET
VON
TETR
91
6.
LITERATURVERZEICHNIS
93
ANHANG |
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