Mechanismus der transkriptionellen Aktivierung von Genen der Phospholipidbiosynthese in Saccharomyces cerevisiae:
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1998
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7
INHALTSVERZEICHNIS
1.
ZUSAMMENFASSUNG
.
13
2.
EINLEITUNG
.
15
2.1.
CIS ELEMENTE
PROTEINKODIERENDER
GENE
IN
S.
CEREVISIAE
.
15
2.2.
DIE
BASALE
TRANSKRIPTIONSMASCHINERIE
.
16
2.3.
TRANSKRIPTIONSAKTIVATOREN
.
20
2.4.
ZIELE
VON
AKTIVIERUNGSDOMAENEN
.
22
2.5.
EINFLUSS
VON
GHROMATINSTRUKTUREN
AUF
DIE
TRANSKRIPTION
.
26
2.6.
TRANSKRIPTIONALE
AKTIVIERUNG
VON
GENEN
DER
PHOSPHOLIPIDBIOSYNTHESE
.
29
3.
ERGEBNISSE
.
33
3.1.
ANALYSE
DER
INO2P
AKTIVIERUNGSDOMAENEN
.
33
3.1.1.
SUCHE
NACH
AKTIVIERUNGSDEFEKTEN
PUNKTMUTANTEN
.
34
3.1.2.
GENAUE
EINGRENZUNG
VON
TAD1
DURCH
GEZIELTE
DELETIONEN
.
38
3.1.3.
MUTAGENESE
DER
FUNKTIONELL
WICHTIGEN
AMINOSAEUREPOSITIONEN
27
UND
28.
.
41
3.2.
FAKTOREN
DER
INO2P-ABHAENGIGEN TRANSKRIPTIONALEN
AKTIVIERUNG
.
43
3.2.1.
SUCHE
NACH
IN
VITRO
WECHSELWIRKUNGEN
VON
INO2P
MIT
KOMPONENTEN
DES
TRANSKRIPTIONSAPPARATES
.
44
3.2.1.1.
KONSTRUKTION
VON
GST
FUSIONEN
MIT
TBP,
TFIIB
UND
ADA2
AUS
HEFE45
3.2.1.2.
EXPRESSION
DER
FUSIONSPROTEINE
IN
E.
COLI
.46
3.2.1.3.
YYFAR
WESTERN
"
ANALYSE
MIT
EINER
INO2P
SONDE
.
49
3.2.2.
EINFLUSS
DES
MUTMASSLICHEN
ADAPTORPROTEINS
ADA5P/SPT20P
AUF
DIE
TRANSKRIPTIONSAKTIVIERUNG
DURCH
INO2P
.
51
3.2.3.
IDENTIFIZIERUNG
VON
SUPPRESSOREN
EINER
NICHT
FUNKTIONELLEN
INO2P
AKTIVIERUNGSDOMAENE
.
55
3.2.3.1.
ERKENNUNG
AKTIVIERUNGSDEFEKTER
INO2P
VARIANTEN
DURCH
EINEN
WACHSTUMSPHAENOTYP
.
55
3.2.3.2.
MUTAGENESE
UND
SELEKTION
VON
SUPPRESSORMUTANTEN
.
56
3.2.3.3.
RUECKKREUZUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER INOSITOLBEDUERFTIGEN
REVERTANTEN
.
58
3.2.3.5.
IDENTIFIZIERUNG
DES
TOR2
GENS
ALS
KOMPLEMENTIERENDER
LESERAHMEN64
8
3.2.3.6.
NACHWEIS
DER
ALLELIE
VON
TOR2
UND
INO81
.
65
3.2.3.7.
KOMPLEMENTATION
ALLER
ISOLIERTEN
SUPPRESSORMUTANTEN
DURCH
TOR2.
70
3.3.
KLONIERUNG
UND
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DES
GENS
IN080
.
72
3.3.1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTANTE
INO80-1
.72
3.3.2.
KOMPLEMENTATION
DER
INO80
MUTANTE
DURCH
TRANSFORMATION
MIT
EINER
PLASMID-GENBANK
.
73
3.3.3.
IDENTIFIZIERUNG
DES
KOMPLEMENTIERENDEN
LESERAHMENS
.
74
3.3.4.
KONSTRUKTION
UND
UNTERSUCHUNG
EINER
AINO80
DELETIONSMUTANTE
.
79
3.3.5.
DELETIONSANALYSE DES
INO80
LESERAHMENS
.
82
3.3.6.
VERGLEICH
DER
INO80
CDNA
MIT
DEM
INO80
GEN
.
83
3.3.7.
TEST
DER
TRANSKRIPTIONSAKTIVIERUNG
DURCH
INO2P
IN
DER
AINO80
MUTANTE
87
3.3.8.
UEBERPRUEFUNG
VON
WECHSELWIRKUNGEN
ZWISCHEN
INO80P
UND
ANDEREN
FAKTOREN
DER
ICRE-ABHAENGIGEN
GENAKTIVIERUNG
.
88
3.3.9.
VERGLEICH
DER
ICRE
BINDEAKTIVITAET
IN
WILDTYP
UND
AINO80
MUTANTE
.
90
3.3.10.
EINFLUSS
DER
AINO80
MUTATION
AUF
ANDERE
AKTIVATOREN
.
94
3.3.11.
MUTAGENESE
EINES
KONSERVIERTEN
LYSINRESTS
IN
DER
MUTMASSLICHEN
ATP
BINDE-STELLE
VON
INOSOP
UND
NACHWEIS
DES
INO80
PROTEINS
DURCH
EPITOPMARKIERUNG
.
100
3.3.12.
BESTIMMUNG
DES
APPARENTEN
MOLEKULARGEWICHTS
VON
INO80P
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
DURCH
GELFILTRATION
.
104
3.3.13.
UNTERSUCHUNG
DER
CHROMATINSTRUKTUR
DES
INO1
PROMOTORS
IN
WILDTYP
UND
AINO80
MUTANTE
.
107
4.
DISKUSSION
.112
5.
MATERIAL
UND
METHODEN
.136
5.1.
VERWENDETE
ORGANISMEN
.
136
5.1.1.
E.
COLI
STAEMME
.
136
5.1.2.
HEFESTAEMME
.
136
5.2.
NAEHRMEDIEN
.
137
5.2.1.
BAKTERIENMEDIUM
.
137
5.2.2.
HEFEMEDIEN
.
137
5.3.
KLONIERUNGSVEKTOREN
UND
PLASMIDE
.
138
5.3.1.
KLONIERUNGSVEKTOREN
.
139
9
5.3.1.1.
E.
CO/AVEKTOREN
.
139
5.3.1.2.
S.
CEREVISIAE/E.
CO/A
"
SHUTTLE"
-VEKTOREN
.
139
5.3.2.
ERHALTENE
PLASMIDE
.
139
5.3.3.
IM
RAHMEN
DIESER
ARBEIT
KONSTRUIERTE
PLASMIDE
(KLONIERUNGSENDPRODUKTE)
.
140
5.4.
OLIGONUKLEOTIDE
.
141
5.5.
BIOCHEMISCHE
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHE
STANDARDPUFFER
.
142
5.6.
KULTIVIERUNG
VON
MIKROORGANISMEN
.
142
5.6.1.
ANZUCHT
VON
E.
CO/AZELLEN
.
142
5.6.2.
ANZUCHT
VON
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE-ZETTEN
.
142
5.7.
ZELLDICHTEBESTIMMUNG
.
142
5.8.
ZELLROHEXTRAKTE
AUS
HEFE
.
143
5.8.1.
ROHEXTRAKTE
FUER
ENZYMTESTS
.
143
5.8.2.
PROTEINEXTRAKTE
FUER
WESTERN
ANALYSEN
.
143
5.8.3.
PROTEINEXTRAKTE
FUER
GELFILTRATIONSEXPERIMENTE
.
144
5.9.
PROTEINBESTIMMUNGEN
.
144
5.9.1.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
DER
MIKROBIURET-METHODE
.
144
5.9.2.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
DER
METHODE
VON
BRADFORD
.
144
5.10.
SS-GALAKTOSIDASE-ENZYMTEST
.
145
5.11.
KLASSISCH-GENETISCHE
TECHNIKEN
.
146
5.11.1.
KONSTRUKTION
DIPLOIDER
HEFESTAEMME
.
146
5.11.2.
ZUFALLSSPORENANALYSE
.
146
5.11.3.
MUTAGENESE
.
146
5.12.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA AUS
E.
COLI
.
147
5.12.1.
PRAEPARATIVE
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
NACH
BIMBOIM/DOLY
.
147
5.12.2.
PRAEPARATIVE
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
MIT
"QIAGEN
"
-MINISAEULEN.
147
5.12.3.
ANALYTISCHE
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
("MINI-SCREEN
"
-ANALYSE)
.
148
5.13.
PLASMIDMUTAGENESE
.
148
5.14.
ISOLIERUNG
VON
RNA
AUS
HEFE
MIT
DEM
YYHIGH
PURE
RNA
ISOLATION
KIT
"
.
149
5.15.
DNA
UND
RNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN
.
150
5.16.
ELEKTROPHORETISCHE
TECHNIKEN
.
150
5.16.1.
ANALYTISCHE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
150
5.16.2.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
150
5.16.3.
ELEKTROPHORESE
BEI
DER
DNA-SEQUENZIERUNG
.
151
10
5.16.4.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
ZUR
PROTEINAUFTRENNUNG
.
152
5.17.
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
MIT
DNA
.
153
5.17.1.
RESTRIKTIONSENDONUKLEASE-SPALTUNG
VON
DNA
.153
5.17.2.
AUFFUELL-REAKTION
5
'
-UEBERSTEHENDER
DNA-FRAGMENTENDEN
.
153
5.17.3.
LIGATION
VON
DNA
.
154
5.17.4.
LINKERINSERTION
.
154
5.18.
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
155
5.18.1.
PCR
ZUR
AMPLIFIKATION
VON
GENOMISCHER
BZW.
PLASMID-DNA
.
155
5.18.2.
PCR
ZU
AMPLIFIZIERUNG
VON
DNA
AUS
GANZEN
ZELLEN
(YYWHOLE
CELL
PCR
"
)
.
.
156
5.18.3.
CDNA
SYNTHESE
FUER
DIE
RT-PCR
.
156
5.18.4.
AUFREINIGUNG
AMPLIFIZIERTER
DNA-FRAGMENTE
MIT
DEM
YYNUCLEOTRAPCR
EXTRACTION
KIT
"
.
157
5.19.
TRANSFORMATIONSTECHNIKEN
.
157
5.19.1.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
NACH
DER
CALCIUMCHLORID-METHODE
.
157
5.19.2.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
DURCH
ELEKTROPORATION
.
158
5.19.3.
HEFETRANSFORMATION
NACH
DER
LITHIUMACETAT-METHODE
.
159
5.20.
DNA-SEQUENZIERUNG
NACH
DER
DIDESOXY-TERMINATIONSMETHODE
.
159
5.20.1.
DENATURIERUNG
DES
DOPPELSTRANGES
.
159
5.20.2.
SEQUENZIERREAKTIONEN
.
160
5.20.3.
AUTORADIOGRAPHIE
DER
SEQUENZIERGELE
.
160
5.21.
GELRETARDIERUNGSEXPERIMENTE
.
160
5.21.1.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
EINE
"
FILL-IN
"
-
REAKTION
.
161
5.21.2.
HERSTELLUNG
DER
PROTEINBINDEEXTRAKTE
.
161
5.21.3.
BINDUNGSREAKTION
UND
RETARDIERUNGS-GELELEKTROPHORESE
.
162
5.22.
HETEROLOGE
EXPRESSION
VON
GST-FUSIONSPROTEINEN
IN
E.COLI
.
163
5.22.1.
ANZUCHT
DER
E.
COLI
TRANSFORMANTEN
ZUR
EXPRESSION
DER
GST
FUSIONSPROTEINE
.163
5.22.2.
AUFREINIGUNG
DER
GST-FUSIONSPROTEINE
UEBER
EINE
AFFINITAETSMATRIX
.
163
5.23.
WESTERN-ANALYSE
.
164
5.23.1.
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
AUF
NITROZELLULOSE
.
164
5.23.2.
IMMUNKOMPLEXBILDUNG
UND
DESSEN
NACHWEIS
.
165
11
5.24.
"FAR-WESTEM
,,
-ANALYSE
ZUR
DETEKTION
VON
IN
VITRO
PROTEIN-PROTEIN
INTERAKTIONEN
.
165
5.25.
UNTERSUCHUNG
VON
CHROMATINSTRUKTUREN
.
167
5.25.1.
PRAEPARATION
VON
HEFEZELLKEMEN
.
168
5.25.2.
MICROCOCCUS
NUKLEASE
VERDAU
UND
ISOLIERUNG
DER
REAKTIONSPRODUKTEI
68
5.25.3.
NACHWEIS
DER
REAKTIONSPRODUKTE
DURCH
SOUTHERN
HYBRIDISIERUNG
.
169
5.26.
GELFILTRATIONSCHROMATOGRAPHIE
.
170
6.
ANHANG
.
172
6.1.
LITERATURVERZEICHNIS
.
172
6.2.
ABKUERZUNGEN
.
189 |
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