Röntgenkristallographische Struktur der Substratbindungsdomäne des Thermosoms: Implikationen für den Mechanismus der Gruppe-II-Chaperonine
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
ZUSAMMENFASSUNG
1
2.
EINLEITUNG
3
2.1.
DAS
THERMOSOM
3
2.2.
CHAPERONE
3
2.3.
CHAPERONINE
5
2.4.
GRUPPE
II-CHAPERONINE
6
2.5.
ZIEL
DER
ARBEIT
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
9
3.1.
BIOCHEMISCH-MOLEKULARBIOLOGISCBE
METHODEN
9
3.1.1.
BIOCHEMISCHE
STANDARDMETHODEN
9
3.1.2.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
STANDARDMETHODEN
9
3.1.3.
REINIGUNG
NATIVER
THERMOSOMEN
AUS
THERMOPLASMA
ACIDOPHILUM
10
3.1.4.
KONSTRUKTION
VON
PLASMIDEN
11
3.1.5.
PROTEINEXPRESSION
IN
ESCHERICHIA
COLI
13
3.1.6.
REINIGUNG
HETEROLOG
EXPRIMIERTER
THERMOSOMEN
13
3.1.7.
GEWINNUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
14
3.1.8.
IMMUNO-BLOT
15
3.1.9.
REINIGUNG
VON
ANTIKOERPERN
15
3.1.10.
DISSOZIATION
UND
REASSEMBLIERUNG
VON
THERMOSOMEN
16
3.1.11.
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
AUFNAHMEN
VON
THERMOSOMEN
17
3.1.12.
BESTIMMUNG
DER
ATPASE-AKTIVITAET
VON
THERMOSOMEN
17
3.1.13.
EINFLUSS
VON
THERMOSOMEN
AUF
DIE
RUECKFALTUNG
VON
RHODANESE
17
3.1.14.
KOMIGRATION
VON
DENATURIERTEM
LYSOZYM
MIT
THERMOSOMEN
18
3.1.15.
WECHSELWIRKUNG
VON
THERMOSOMEN
MIT
DENATURIERTEM
GFP
18
3.1.16.
ANALYSE
VON
THERMOSOMENGEBUNDENEN
POLYPEPTIDEN
18
3.1.17.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DER
APIKALEN
DOMAENEN
DES
THERMOSOMS
19
3.2.
KRISTALLOGRAPHISCHE
METHODEN
20
3.2.1.
KRISTALLISATION
DER
APIKALEN
DOMAENE
20
3.2.2.
KRISTALLOGRAPHISCHE
DATENERFASSUNG
20
3.2.3.
STRUKTURLOESUNG
DURCH
MULTIPLEN
ISOMORPHEN
ERSATZ
(MIR)
21
3.2.4.
ATOMARES
MODELL
DER
APIKALEN
DOMAENE
21
3.2.5.
MOLEKULARER
ERSATZ
(MR)
22
3.2.6.
STRUKTURANALYSE
UND
SEQUENZALIGNMENT
23
3.2.7.
MODELLIERUNG
DES
GESAMT-THERMOSOMS
23
4.
ERGEBNISSE
25
4.1.
REINIGUNG
VON
THERMOSOMEN
2
5
4.2.
DISSOZIATION
UND
REASSEMBLIERUNG
VON
THERMOSOMEN
28
4.3.
ANORDNUNG
DER
UNTEREINHEITEN
IM
THERMOSOM
32
4.4.
NATUERLICHE
SUBSTRATE
DES
THERMOSOMS
34
4.5.
WECHSELWIRKUNG
DES
THERMOSOMS
MIT
DENATURIERTEN
PROTEINEN
36
4.6.
STRUKTUR
UND
FUNKTION
DER
APIKALEN
DOMAENE
DES
THERMOSOMS
39
4.6.1.
REINIGUNG
UND
EXPRESSION
DER
APIKALEN
DOMAENE
39
4.6.2.
KRISTALLISATION
DER
APIKALEN
DOMAENE
40
4.6.3.
MULTIPLER
ISOMORPHER
ERSATZ
42
4.6.4.
STRUKTUR
DER
APIKALEN
DOMAENE
(KRISTALLFORM
A)
43
4.6.5.
HYDROPHOBIZITAET
DER
APIKALEN
DOMAENE
45
4.6.6.
STRUKTUR
DER
APIKALEN
DOMAENE
(KRISTALLFORM
B)
47
4.6.7.
DIE
APIKALE
DOMAENE
IM
GESAMT-THERMOSOM
48
5.
DISKUSSION
51
5.1.
CHAPERONIN-FUNKTION
DES
THERMOSOMS
51
5.2.
SUBSTRATBINDUNG
DURCH
GRUPPE
II*CHAPERONINE
52
5.3.
CHAPERONIN-AKTIVITAET
UND
KONFORMATIONSAENDERUNGEN
55
5.4.
KONFORMATIONEN
DER
GRUPPE
II-CHAPERONINE
55
5.5.
KATALYTISCHER
ZYKLUS
DER
GRUPPE
II-CHAPERONINE
57
5.6.
GESCHLOSSENE
KONFORMATION
DES
THERMOSOMS
59
5.7.
AUSBLICK
60
6.
LITERATUR
61
7.
ABKUERZUNGEN
73
VI |
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