RT-PCR (reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion) zum Nachweis der Expression von UDP-Glucuronosyltransferasen in menschlichen Geweben:
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| Published: |
1998
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
DIE
REVERSE
TRANSKRIPTASE-POLYMERASE-KETTENREAKTION
1
1.1.1.
BEDEUTUNG
FUER
MEDIZINISCHE
FRAGESTELLUNGEN
1
1.1.2.
QUANTIFIZIERUNG
VON
MRNA
MITTELS
RT-PCR
2
1.2.
UEDP-GLUCURONOSYLTRANSFERASEN
(
UGT
)
4
1.2.1.
BEDEUTUNG
DER
UGTS
FUER
DEN
FREMDSTOFFWECHSEL
4
1.2.2.
UGT-SUPERGENFAMI
1
I
E
5
1.2.3.
SUBSTRATSPEZ
I
F
ITAET
8
2.
AUFGABENSTELLUNG
9
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
10
3.1.
LOESUNGEN
10
3.2.
MENSCHLICHES
GEWEBE
11
3.3.
GELELEKTROPHORESE
11
3.3.1.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
11
3.3.2.
PAGE
FUER
DIE
AUFTRENNUNG VON
RT-PCR-PRODUKTEN
11
3.3.3.
SEQUENZIERGELELEKTROPHORESE
12
3.4.
DNA-ISOLIERUNG
AUS
AGAROSEGELEN
12
3.5.
METHODEN
DER
DNA-MODIFIZIERUNG
13
3.5.1.
ENZYMRESTRIKTIONSVERDAU
13
3.5.2.
HERSTELLUNG
VON
GLATTEN
DNA-ENDEN
13
3.5.3.
PHOSPHORYLIERUNG
DER
5
'-ENDEN
VON
PCR-PRODUKTEN
13
3.5.4.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-ENDEN
14
3.5.5.
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
IN
PLASMIDE
14
3.6.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
14
3.7.
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
MIT
PLASMIDEN
15
3.8.
PLASMID-ISOLIERUNG
16
3.8.1.
PLASMID-MINIPRAEPARATIONEN
16
3.8.2.
PLASMID-MAXIPRAEPARATIONEN
17
_
SEITE
3.9.
SEQUENZIERUNG
VON
PLASMID-DNA
18
3.10.
RNA-GEWINNUNG
19
3.10.1.
ISOLIERUNG
VON
RNA
AUS
BIOPSIEN
19
3.10.2.
IN
VITRO
MRNA-SYNTHESE
19
3.11.
REVERSE
TRANSKRIPTASE-POLYMERASE-KETTENREAKTION
20
3.11.1.
REVERSE
TRANSKRIPTASE-REAKTION
(RT-REAKTION)
20
3.11.2.
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
21
3.11.2.1.
PRIMER
21
3.11.2.2.
PCR
:
"COLD
START"/"HOT
START"-BEDINGUNGEN
21
4.
ERGEBNISSE
23
4.1.
ETABLIERUNG
DER
RT-PCR
FUER
DIE
UGT1.6
23
4.1.1.
BEDEUTUNG DER DNA
KONTAMINATION
FUER
DIE
RT-PCR
(PRIMER
AUF
EXON
1
BESCHRAENKT)
23
4.1.2.
RT-PCR
MIT
INTRON-UEBERSPANNENDEN PRIMERN
26
4.1.3.
IDENTIFIZIERUNG
DER
RT-PCR-BANDEN
MITTELS
SEQUENZANALYSE
26
4.1.4.
BEDEUTUNG
DER
HYBRIDISIERUNGSTEMPERATUR/
VERGLEICH
"COLD
START"
UND
"HOT
START"
30
4.1.5.
QUALITATIVE
RT-PCR
UNTER
"HOT
START"-BEDINGUNGEN
BEI
EINER
HYBRIDISIERUNGSTEMPERATUR
VON
65
'
C
30
4.2.
HERSTELLUNG
KOMPETITIVER
MRNA
FUER
DIE
QUANTITATIVE
RT-PCR-METHODE
33
4.2.1.
KLONIERUNG
VON
CDNA
DER
UGT1.6
34
4.2.2.
INTEGRATION
DER
KLONIERTEN
CDNA
IN
EINEN
TRANSKRIPTIONSVEKTOR
MIT POLY-DA
SEQUENZ
37
4.2.3.
MODIFIZIERUNG
KLONIERTER
CDNA
DER
UGT1.6
37
4.2.4.
SYNTHESE VON
KOMPETITIVER
MRNA
39
4.3.
ETABLIERUNG
DER QUANTITATIVEN
RT-PCR
43
4.3.1.
KOMPETITIVE
RT-PCR
MIT
IN
VITRO
HERGESTELLTER
MRNA
43
4.3.2.
KOMPETITIVE
RT-PCR
MIT
GESAMT-RNA
AUS
GEWEBEN
45
4.3.3.
ABSCHAETZUNG
VON
UGT1.6
MRNA
IN
DUODENALBIOPSIEN
UND
LEBERGEWEBE
(EXTERNE
STANDARDISIERUNG)
45
_
_
SEITE
5.
DISKUSSION
54
5.1.
ETABLIERUNG
DER
RT-PCR
ZUM
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DER
UGT1.6
IN
GERINGEN
GEWEBSPROBEN
54
5.2.
SEQUENZANALYSEN
DER
UGT1
.6
UND
UGT1
.1
56
5.3.
EXPRESSION
DER
UGT-MRNA
IN
DUODENALBIOPSIEN
57
5.3.1.
TRANSKRIPTE
DER
UGT1.1
57
5.3.2.
TRANSKRIPTE
DER
UGT1
.6
58
6.
ZUSAMMENFASSUNG
61
7.
LITERATUR
63 |
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