Aufklärung der Internalisierung und intrazellulären Route des Endiin-Chromo-Antibiotikums Neocarzinostatin:
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| Format: | Abschlussarbeit Mikrofilm Buch |
| Sprache: | German |
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1997
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| Beschreibung: | Münster (Westfalen), Univ., Diss., 1997. - Mikrofiche-Ausg.: 3 Mikrofiches : 24x |
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG UND ZIEL DER ARBEIT.1
1.1 DM
ENDIIN-CHROMO-ANTIBIOTIKUM NEOCARZINOSTATIN.1
1.1.1 ENDIIN-ANTIBIOTIKA: EINE EINFUEHRUNG.1
1.1.2 STRUKTUR UND WIRKUNGSMECHANISMUS VON NEOCARZINOSTATIN .4
1.1.3 BIOSYNTHESE VON NEOCARZINOSTATIN 16
1.1.4 INTERNALISIERUNG VON NEOECARZINOSTATIN.18
1.1.5 NEOCARZINOSTATIN UND DESSEN IMMUNKONJUGATE IN DER TUMORTHERAPIE.19
1.1.5.1 ZYTOTOXIZITAET, PHARMAKOLOGIE UND BIODISTRIBUTION VON
NEOCARZINOSTATIN . 19
1.1.5.2 NEOCARZINOSTATIN-ANTIKOERPER-KONJUGATE.20
1.2 ZIEL DER ARBEIT.23
2. MATERIAL UND METHODEN .24
2.1 MATERIAL.24
2.1.1 HEFE- UND BAKTERIENSTAMME .24
2.1.2 HUMANE TUMORZELLINIEN .24
2.1.3 MONOKLONALE ANTIKOERPER .25
2.1.4 RADIOCJIEMIKALIEN, ZYTOSTATIKA UND ENZYME .25
2.1.5 SPEZIALCHEMIKALIEN.26
2.1.6 NAEHRBOEDEN UND KULTURMEDIEN .26
2.1.5 LOESUNGEN UND PUFFER .29
2.1.7 GERAETE UND MESSSYSTEME.32
2.1.7.1 MIKROSKOPE .32
2.1.7.2 ELEKTROPHORESE.32
2.1.7.3 HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHIE (HPLC).33
2.1.7.4 FAST PROTEIN UQUID CHROMATOGRAPHIE (FPLC).33
2.1.7.5 CHROMATOGRAPHIE-SAEULEN .33
2.1.7.6 OPTISCHE MESSSYSTEME: LASER-DENSITOMETER, UV/VIS-
SPEKTRALPHOTOMETER
UND FLUORESZENZ-SPEKTROMETER .34
2.1.7.7 BETA- UND GAMMA-SZINTILATIONSZAEHLER .35
2.1.7.8 GERAETE FUER DIE HALTUNG UND PRAEPARATION VON ZEUELNIEN .35
2.1.7.9 ZENTRIFUGEN .35
2.2 MIKROBIOLOGISCHE UND BIOCHEMISCHE METHODEN.36
2.2.1 BIOSYNTHESE DES ANTITUMOR-ANTIBIOTIKUMS NEOCARZINOSTATIN. 36
2.2.1.1 STANDARDISIERUNG DER SPORENINOCULA .36
2.2.1.2 VORTESTS AUF ANTIBIOTIKA-PRODUKTION, MORPHOLOGIE UND WACHSTUM.36
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/954279638
2.2.1.3 ANALYSE DER NCS-PRODUKTIONS-KINETIKEN IN SUBMERSKULTUR.37
2.2.1.3.1
BESTIMMUNG DES TROCKENGEWICHTS.38
2.2.1.3.2
BESTIMMUNG DER NEOCARZINOSTATIN-KONZENTRATION DURCH
PLATTENDIFFUSIONSTEST.39
2.2.1.3.4 BESTIMMUNG DER GLUCOSE-KONZENTRATION.39
2.2.1.3.5 BESTIMMUNG VON PHOSPHAT-KONZENTRATION UND PH-WERT.39
2.2.2 [
14CJ-MARKIERUNG DES NEOCARZINOSTATIN-CHROMOPHORS.41
2.2.2.1 BIOSYNTHESE VON [
14C]-CHROMOPHOR-NEOCARZINOSTATIN .41
2.2.3 ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON [
14CJ-CHROMOPHOR NEOCARZINOSTATIN.43
2.2.3.1
FRAKTIONIERTE AMMONIUMSULFAT-FAELIUNG.43
2.2.3.2
GELFILTRATIONS-CHROMATOGRAPHIE .44
2.2.3.3 ISOLIERUNG VON HOLO- UND APO-NEOCARZINOSTATIN DURCH
ANIONENAUSTAUSCH-
CHROMATOGRAPHIE.45
2.2.3.4 ISOLIERUNG VON HOLO- UND APO-NEOCARZINOSTATIN DURCH HYDROPHOBE
INTERAKTIONS-CHROMATOGRAPHIE.
46
2.2.4 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON [14C]-CHROMOPHOR.47
2.2.4.1 TRENNUNG VON [
14C]-CHROMOPHOR UND APO-PROTEIN DURCH
METHANOLEXTRAKTION.47
2.2.4.2 TRENNUNG VON NATIVEM UND INAKTIVEM [14C]-CHROMOPHOR DURCH
REVERSED
PHASE CHROMATOGRAPHIE.
47
2.2.5 BESTIMMUNG DER [14C]-SUBSTITUTIONS-RATE VON CHROMOPHOR,
HOLO- UND APO-PROTEIN.
48
2.2.6 DARSTELLUNG UND ISOLIERUNG VON TUMORSPEZIFISCHEN NEOCARZINOSTATIN-
ANTIKOERPER-KONJUGATEN.48
2.2.6.1 THIOLIERUNG VON ANTIKOERPERN . 49
2.2.6.2 EINFUEHRUNG VON MALEIMIDGRUPPEN IN NEOCARZINOSTATIN.50
2.2.6.3 KOPPLUNG VON THIOLIERTEN MONOKLONALEN ANTIKOERPERN MIT SMCC-
NEOCARZINOSTATIN .
88
2.2.7 FLUOROCHROMKOPPLUNGEN .51
2.2.7.1 DARSTELLUNG UND REINIGUNG VON HOLO- UND APO-NCS-FLUOROCHROM-
KONJUGATEN .
51
2.2.7.2 DARSTELLUNG UND REINIGUNG VON FLUOROCHROM-NCS-LMMUNKONJUGATEN
. 51
2.2.7.3 BESTIMMUNG DES FLUOROCHROM/PROTEIN-QUOTIENTEN .52
2.2.8
INTERMOLEKULARE KONJUGATION VON KOLLOIDALEM GOLD MIT PROTEINEN .53
2.2.8.1 HERSTELLUNG VON KOLLOIDALEM GOLD DEFINIERTER GROESSE .53
2.2.8.2 ANALYTISCHE GOLDKOPPLUNG.54
2.2.8.3 DARSTELLUNG VON MONODISPERSEN PROTEIN-GOLD-KONJUGATEN.54
2.2.9 CHARAKTERISIERUNG VON [
14C]-CHROMOPHOR-NEOCARZINOSTATIN UND DESSEN
KONJUGATEN
.55
2.2.9.1 CHROMATOGRAPHISCHE METHODEN.55
2.2.9.2 UV/VIS-SPEKTROSKOPIE .56
2.2.9.3 FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE.56
2.2.9.3 ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG .57
2.2.9.4 SDS-GELELEKTROPHORESE
. V.57
2.2.9.5 PROZESSORGESTEUERTE SILBERFAERBUNG VON
POLYACRYIAMID-PHAST-GELEN.58
2.3 ZELLBIOLOGISCHE ARBEITSTECHNIKEN .59
2.3.1 HALTUNG UND VERMEHRUNG VON HUMANEN TUMORZELLINIEN.59
2.3.1.1 GEFRIERKONSERVIERUNG VON ZELLEN .59
2.3.1.2 VERMEHRUNG UND PASSAGIERUNG.59
2.4 ZELLBIOLOGISCHE BINDUNGS- UND INTEMALISIERUNGSEXPERIMENTE.60
2.4.1 KONTROLLE VON ANTIGENEXPRESSION UND BESTIMMUNG VON
BINDUNGSAKTIVITAETEN . 60
2.4.1 ZELL-EIA.'.60
2.4.2 BESTIMMUNG DER BIOLOGISCHEN AKTIVITAET .61
2.4.2.2 BESTIMMUNG DER ZYTOTOXISCHEN AKTIVITAET.61
2.4.2.2 BESTIMMUNG DER ZYTOSTATISCHEN AKTIVITAET.62
2.4.2.3 TOXIZITAETSFAKTOR .63
2.4.3 ZELLPRAEPARATION MIT MARKIERTEM NEOCARZINOSTATIN, CHROMOPHOR UND
IMMUNKONJUGATEN.63
2.4.3.1 RHODAMIN- UND RUORESCEIN-ISOTHIOCYANAT-KONJUGATE .63
2.4.3.2 MONODISPERSE GOLD-KONJUGATE.64
2.4.3.3 SILBERVERSTAERKUNG MEMBRANGEBUNDENER UND INTEMALISIERTER
PROTEIN-GOLD-KONJUGATE .64
2.4.3.3 [14 CJ-CHROMOPHOR-NEOCARZINOSTATIN.65
2.4.4 HISTOLOGISCHE TECHNIKEN.66
2.4.4.1 VITALFAERBUNGEN .66
2.4.4.2 FIXIERUNGSTECHNIKEN .66
2.4.4.3 ZELLEINBETTUNG IN KUNSTHARZ.67
2.4.4.4 ULTRA- UND SEM DUENNSCHNITTE.69
2.4.5 LICHT- FLUORESZENZ- UND KONFOKALE LASER SCAN FLUORESZENZ
MIKROSKOPIE.69
2.4.6 ELEKTRONENMIKROSKOPIE .70
2.4.7 ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE AUTORADIOGRAPHIE. 71
2.4.8.1 VORBEREITUNG DER ULTRADOENNSCHNITTE.72
2.4.8.2 MONOLAYER- UND BILAYER-BESCHICHTUNG MIT NUDEAR-EMULSION.74
2.4.8.3 EXPOSITION .76
2.4.8.4 ENTWICKLUNG.77
3. ERGEBNISSE .78
3.1 UEBERSICHT UND STRATEGIE.78
3.2 BIOSYNTHESE VON NEOCARZI NOSTATIN .79
3.2.1 SELEKTION VON
STREPTOMYCES CARZINOSTATICUS VARIANTEN NACH
ANTIBIOTIKA-PRODUKTION, MORPHOLOGIE UND WACHSTUM.79
3.2.3 WACHSTUMS- UND PRODUKTIONS-KINETIKEN VON
S. CARZINOSTATICUS ATCC 15944,
ATCC 15945 UND BOSTON .
79
3.2.3.1 KINETIK DER NCS-PRODUKTION VON S. CARZINOSTATICUS ATCC 15944 .
80
3.2.3.2 KINETIK DER NCS-PRODUKTION VON
S. CARZINOSTATICUS ATCC 15945 . 82
3.2.3.3 KINETIK DER NCS-PRODUKTION VON S. CARZINOSTATICUS BOSTON .83
3.2.3.4 PRODUKTIONS-EFFIZIENZEN DER
S. CARZINOSTATICUS VARIANTEN IM VERGLEICH . 85
3.3 BIOSYNTHESE UND PROTEKTION DES [
14C1 - CHROMOPHORS.86
3.3.2 KINETIKEN DER CHROMOPHOR- UND NCS-PROTEIN-BIOSYNTHESE .87
3.3.2.1 QUALITATIVE UND QUANTITATIVE ANALYSE VON HOLO- UND
APO-NCS IN NG-MEDIUM.
88
3.3.2.2 QUANTIFIZIERUNG DES PRODUZIERTEN CHROMOPHORS.92
3
.
3.3
EINFLUSS VON NA-ACETAT AUF DIE CHROMOPHOR-BIOSYNTHESE.95
3.3.4 OPTIMIERUNG DER ACETAT-KONZENTRATION FUER DIE
CHROMOPHOR-BIOSYNTHESE
UND STABILISIERUNG DES AKTIVEN FREIEN CHROMOPHORS .96
3.3.4.1 ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON APO-NCS.96
3.3.4.2 EINFLUSS VON ACETAT AUF DIE SYNTHESE VON HOLO-NEOCARZINOSTATIN
.97
3.3.5 BIOSYNTHESE VON [
14C]-CHROMOPHOR UND ASSOZIATION MIT APO-NCS . 100
3.4 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON [
14C]-CHROMOPHOR-NEOCARZINOSTATIN 101
3.4.1 ISOLIERUNG VON [
14C]-CHROMOPHOR-NCS DURCH FRAKTIONIERTE AMMONIUM
SULFATFAELLUNG .
102
3.4.3 ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON [14CJ-CHROMOPHOR-NCS DURCH HYDROPHOBE
INTERAKTIONS-CHROMATOGRAPHIE .
102
3.4.4 BESTIMMUNG DER MOLEKUELGROESSE VON [
14C]-CHROMOPHOR NEOCARZINOSTATIN . 104
3.4.4.1 GELFILTRATIONS-CHROMATOGRAPHIE .15
3.4.4.2 MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG UND REINHEITSKONTROLLE VON
[
14C]-CHROMOPHOR-NCS DURCH SDS-GELELEKTROPHORESE .106
3.4.5 BESTIMMUNG DES ISOLELEKTRISCHEN PUNKTES VON [
14C]-CHROMOPHOR-NCS.109
3.4.6 ZYTOTOXIZITAET VON [
,4C]-CHROMOPHOR-NEOCARZINOSTATIN.110
3.5 CHARAKTERISIERUNG DES [
,4C]-CHROMOPHORS. 109
3.5.1 VERTEILUNG DER [
,4C]-AKTIVITAET IN CHROMOPHOR UND NEBENPRODUKTEN.109
3.5.2 [
14C]-LSOTOPEN-GEHALT DES CHROMOPHORS.110
3.5.3 EFFIZIENZ DER
IN VIVO MARKIERUNG DES CHROMOPHORS MIT [1 -14C]-ACETAT .112
3.5.4 SPEKTROMETRISCHE EIGENSCHAFTEN DES ISOLIERTEN [
14C]-CHROMOPHORS.113
3.5.5 HPLC-ANALYSE VON AKTIVEM UND INAKTIVEM [
14C]-CHROMOPHOR.115
3.6 DARSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON
NEOCARZINOSTATIN-IMMUNKONJUGATEN . 116
3.6.1 VERLAUF DER KOPPLUNGSREAKTIONEN.117
3.6.2 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER
NEOCARZINOSTATIN-IMMUNKONJUGATE
. 121
3.6.3 ANTIGENBINDUNG UND ZYTOTOXIZITAET DER NCS-LMMUNKONJUGATE .123
3.7 DARSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON NCS-FLUOROCHROM- UND NCS-
ANTIKOERPER-FLUOROCHROM-KONJUGATEN. 125
3.7.1 VERLAUF DER KOPPLUNGSREAKTIONEN. 125
3.7.2 SPEKTROSKOPISCHE EIGENSCHAFTEN UND SUBSTITUTIONSRATEN DER
FLUOROCHROM-KONJUGATE . 127
3.7.3 BIOLOGISCHE AKTIVITAET DER FLUOROCHROM-KONJUGATE. 129
3.8 MONODISPERSE NCS- UND NCS-ANTIKOERPER-GOLD-KONJUGATE FUER DIE
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
. 130
3.9 INTERNALISIERUNG UND INTRAZELLULAERE ROUTE VON NEOCARZINOSTATIN,
DESSEN
CHROMOPHOR UND IMMUNKONJUGATEN
. 132
3.9.1 ZELLULAERE AUFNAHME VON HOLO- UND APO-NEOCARZINOSTATIN . 132
3.9.2 ENDOZYTOSE VON HOLO- UND APO-NEOCARZINOSTATIN.144
3.9.3 REZEPTORVERMITTELTE ENDOZYTOSE VON HOLCHNCS BEI 791T-ZELLEN . 153
3.9.4 INTRAZELLULAERE ROUTE VON' GOLDKONJUGIERTEM HOLO- UND APO-NCS. 155
3.9.5 INTERNALISIERUNG VON 791 T/36- UND OV-TL3-NCS-LMMUNKONJUGATEN. 162
3.9.6 INTRAZELLULAERE LOKALISATION DES [
14C]-CHROMOPHORS DURCH EM-AUTORADIOGRAPHIE 171
4. DISKUSSION.177
4.1
BIOSYNTHESE VON NEOCARZINOSTATIN UND DES [UC]-ENDIIN-CHROMOPHORS. 177
4.2 KRITISCHE BETRACHTUNG DER KOPPLUNGS- UND MARKIERUNGSTECHNIKEN . 181
4.3
INTERNALISIERUNG UND INTRAZELLULAERE ROUTE DES NEOCARZINOSTATIN-PROTEINS.
183
4.4
INTERNALISIERUNG DES [UC]-ENDIIN-CHROMOPHORS.187
4.5
INTERNALISIERUNG DER NEOCARZINOSTATIN-IMMUNKONJUGATE. 190
4.6 RESUEMEE UND AUSBLICK. 192
\
5. ZUSAMMENFASSUNG. 195
6. LITERATURVERZEICHNIS . 197 |
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