Physiologische Charakterisierung und genetische Untersuchung cadmium-resistenter Mutanten und Transformanten bei Schizosaccharomyces pombe:
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
DIE
HEFE
SCHIZOSACCHAROMYCES
POMBE
1
1.2.
SCHWERMETALLE
IN
DER
UMWELT
1
1.3.
DIE
BIOLOGISCHE
ROLLE
VON
SCHWERMETALLEN
2
1.4.
SCHWERMETALLBINDENDE
PEPTIDE
4
1.5.
VERMINDERTER
INFLUX
ODER
VERSTAERKTER
EFFLUX
VON
SCHWERMETALLIONEN
ALS
RESISTENZMECHANISMUS
6
1.6.
PROBLEMSTELLUNG
7
2.
MATERIAL
8
2.1.
ABKUERZUNGEN
8
2.2.
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
9
2.3.
STAEMME
UND
PLASMIDE
9
2.3.1.
SCHIZOSACCHAROMYCESPOMBE-STAENAAE
10
2.3.2.
ESCHERICHIA
CO/I-STAMM
10
2.3.3.
PLASMIDE
10
2.4.
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
ZUR
SEQUENZIERUNG
11
2.5.
MEDIEN
11
2.6.
PUFFER
UND
LOESUNG
14
3.
METHODEN
15
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
3.1.
HEFEDAUERKULTUR
15
3.2.
BAKTERIENDAUERKULTUR
15
3.3.
ANZUCHT
DER
BAKTERIENKULTUREN
15
PHYSIOLOGISCHE
/ENZYMATISCHE
METHODEN
3.4.
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAET
DER
ALKOHOL-DEHYDROGENASE
(ADH)
NACH
BRUCHMANN
(1976)
16
3.5.
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAET
DER
GLUCOSE-6-PHOSPHAT-DEHYDROGENASE
NACH
DEAN
UND
WATSON
(1979)
17
3.6.
BESTIMMUNG
DER
ATMUNGSRATE
18
3.6.1.
BEHANDLUNG
DER
ZELLEN
MIT
CADMIUM
18
3.6.2.
ISOLATION
VON
MITOCHONDRIEN
UND
BESTIMMUNG
IHRER
ATMUNGSRATE
18
3.7.
RP-HPLC-MESSUNG
19
GENETISCHE
METHODEN
3.8.
KREUZUNGSEXPERIMENTE
UND
GEWINNUNG
MITTELRESISTENTER
MUTANTEN
AUS
DER
MUTANTE
RI
7
19
3.8.1.
METHODE
DER
KREUZUNG
ZWISCHEN
ZELLEN
UNTERSCHIEDLICHEN
PAARUNGSTYPS
19
3.8.2.
ISOLATION
DER
ASCOSPOREN
19
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
3.9.
KONSTRUKTION
EINER
GENOMISCHEN
DNA-BANK
AUS
DER
MITTELRESISTENTEN
MUTANTE
M20
20
3.9.1.
ISOLATION
GENOMISCHER
DNA
20
3.9.2.
ANALYTISCHE
PARTIALRESTRIKTION
DER
GENOMISCHEN
DNA
DER
MITTELRESISTENTEN
MUTANTE
M20
21
3.9.3.
PRAEPARATIVER
PARTIALVERDAU
DER
GENOMISCHEN
DNA
DER
MITTELRESISTENTEN
MUTANTE
M20
22
3.10.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
22
3.10.1.
MINIPRAEPARATION
VON
PLASMIDEN
22
3.10.2.
MAXIPRAEPARATIONEN
VON
PLASMIDEN
23
3.11.
TRANSFONNATION
VON
E.
COLI
NACH
DER
RUBIDIUMCHLORID-METHODE
23
3.12.
LIGATIONEN
VON
YYSTICKY-END
"
UND
YYBLUNT-END
"
25
3.13.
TRANSFORMATION
DES
WILDTYPS
D
18
25
3.14.
UEBERPRUEFUNG
DER
RESISTENZ
DER
TRANSFORMANTE
GEGEN
CD
2+
25
3.15.
PLASMIDVERLUSTTEST
26
3.16.
ISOLATION
UND
REINIGUNG
VON
PLASMIDEN
AUS
S.
POMBE
26
3.17.
DNA-RESTRIKTION
26
3.18.
AGAROSEGELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
27
3.19.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
27
3.19.1.
YYFREEZE-SQUEEZE
"
27
3.19.2.
LMP-AGAROSE
UND
SS-AGARASE
27
3.20.
DNA-SEQUENZIERUNG
27
3.20.1.
SEQUENZIERREAKTIONEN
28
3.20.2.
AUFTRENNUNG
UND
DETEKTION
DER
SEQUENZIERPRODUKTE
MIT
DEM
,A.L.F.YY
DNA
SEQUENCER
"
28
4.
ERGEBNISSE
29
4.1.
AKTIVITAET
ZENTRALER
ENZYME
DES
STOFFWECHSELS
29
4.2.
ATMUNGSRATE
DER
MIT
UNTERSCHIEDLICHEN
CD
2+
-KONZENTRATIONEN
BEHANDELTEN
MUTANTE
R17
UND
DES
WILDTYPS
29
4.2.1.
UNTERSCHIEDE
DER
ATMUNGSRATE
ZWISCHEN
DER
MIT
CD
2+
BEHANDELTEN
MUTANTE
RI
7
UND
DEM
WILDTYP
30
4.2.2.
ATMUNGSRATE
DER
ISOLIERTEN
MITOCHONDRIEN
DER
MUTANTE
RI
7
UND
DES
WILDTYPS
31
4.3.
GENETISCHE
ANALYSE
DER
MUTANTEN
RI
7
UND
M20
32
4.3.1.
GENETISCHE
ANALYSE
DER
MUTANTE
RI
7
32
4.3.2.
PHYSIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
MITTELRESISTENTEN
SEGREGANTEN
M20
38
4.3.3.
ANALYSE
DES
PHYTOCHELATINGEHALTS
BEI
M20
UND
DEM
WILDTYP
40
4.3.4.
KREUZUNGSEXPERIMENTE
UND
ANALYSE
VON
DREI
PHAENOTYPEN
40
4.4.
KONSTRUKTION
DER
GENOMISCHEN
DNA-BANK
DER
MITTLERESISTENTEN
MUTANTE
M20
42
4.4.1.
DER
VEKTOR
PUR
19
42
4.4.2.
ISOLATION
GENOMISCHER
DNA
43
4.4.3.
ANALYTISCHER
UND
PRAEPARATIVER
PARTIALVERDAU
MIT
SAU 3A
44
4.4.4.
LIGATION
UND
QUALITAET
DER
GENOMISCHEN
DNA-BANK
44
4.5.
TRANSFORMATION
DES
WILDTYPS
(
D18)
MIT
DER
GENBANK
DER
RESISTENTEN
MUTANTE
45
4.6.
VERLUSTEXPERIMENT
DES
PLASMIDS
PUR
19
MIT
INSERT
46
4.7.
PHYSIOLOGIE
DER
TRANSFORMANTE
T68
48
4.8.
ISOLATION
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
KOMPLEMENTIERTEN
PLASMIDS
50
4.8.1.
CHARAKTERISIERUNG
DES
PLASMIDS
MIT
INSERT
50
4.8.1.1.
GROESSENBESTIMMUNG
DER
DNA-INSERTS
50
4.8.1.2.
PRIMAERE
KARTIERUNG
DES
DNA-INSERTS
51
4.8.2.
UEBERPRUEFUNG
CD-RESISTENZ
DER
TRANSFORMANTE
52
4.8.3.
ANALYTIK
DER
DNA
SUBKLONESKARTE
53
4.9.
DAS
KOMPLEMENTIERENDE
DNA-FRAGMENT
54
4.9.1.
FESTSTELLUNG
DES
KOMPLEMENTIERENDEN
DNA-FRAGMENTES
54
4.9.2.
KARTIERUNG
DES
KOMPLEMENTIERENDEN
DNA-FRAGMENTES
55
4.10.
PLASMIDVEKTOR
PUC
19
56
4.11.
DNA-SEQUENZANALYSE
DES
INSERTS
56
4.11.1.
SEQUENZIERUNGSSTRATEGIE
56
4.11.2.
SEQUENZ
DER
INSERT-DNA
57
4.12.
TRANSFORMATION
EINER
FUER
CD
2+
SENSIBLEN
MUTANTE
MIT
DEM
PLASMID
MIT
DEM
INSERT
64
5.
DISKUSSION
65
5.1.
PHYSIOLOGISCHE
EIGENSCHAFTEN
DER
MUTANTEN
R17
UND
M20
65
5.2.
GENETISCHE
ANALYTIK
VON
R17
UND
M20
69
5.3.
ANALYSE
DER
RESISTENTEN
TRANSFORMANTEN
70
5.4.
WEITERE
RESISTENZMECHANISMEN
71
5.5.
ANWENDUNGEN
DER
SCHWERMETALL-DETOXIFIZIERUNG
76
5.6.
AUSBLICK
77
6.
ZUSAMMENFASSUNG
79
7.
LITERATURVERZEICHNIS
81 |
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