Die strukturellen Determinanten der S'-Bindungsortspezifitäten in den Serinproteasen Trypsin und Chymotrypsin:
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1998
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
1. EINLEITUNG 1
2. ALLGEMEINER TEIL
2.1. ENZYMOLOGISCHE GRUNDLAGEN DER SERINPROTEASEN 6
2.1.1. KATALYSEMECHANISMUS 6
2.1.2. SERINPROTEASE-FAMILIEN ALS BEISPIEL FUER KONVERGENTE EVOLUTION 8
2.1.3. TRYPSINOGEN ALS PROTOTYP DER ZYMOGENAKTIVIERUNG 8
2.1.4. BEITRAEGE ZUR ENZYMOLOGIE DES TRYPSINOGENS 10
2.1.4.1. TRYPSINOGEN-KATALYSIERTE KNUEPFUNG EINER PEPTIDBINDUNG 11
2.1.4.2. TRYPSINMUTANTEN MIT STABILER ZYMOGENKONFORMATION 13
2.2. STRUKTURELLE GRUNDLAGEN DER SUBSTRATSPEZIFITAET IN DER
CHYMOTRYPSINFAMILIE AM BEISPIEL DES TRYPSINS 15
2.2.1. SUBSTRATSPEZIFITAET DER SERINPROTEASEN 16
2.2.2. STRUKTURELLE DETERMINANTEN DER S1-SPEZIFITAET DES TRYPSINS 17
2.2.2.1. UMWANDLUNG VON TRYPSIN IN CHYMOTRYPSIN 19
2.2.2.2. KINETISCHE GRUNDLAGEN DER SUBSTRATSPEZIFITAET VON SERINPROTEASEN
21
2.3. STRUKTURELLE GRUNDLAGEN DER S'-BINDUNGSORTSPEZIFITAET 22
2.3.1. CHARAKTERISIERUNG DER S'-BINDUNGSORTE VON SERINPROTEASEN 23
2.3.2. STUDIEN ZUR S'-SPEZIFITAET DER SERINPROTEASEN TRYPSIN UND 26
CHYMOTRYPSIN
2.3.3. STRUKTURELLE DETERMINANTEN DER S1 '-SPEZIFITAET VON TRYPSIN UND 28
CHYMOTRYPSIN
2.3.3.1. UMWANDLUNG VON TRYPSIN IN CHYMOTRYPSIN - MODULATION DER 32
S1'-SPEZIFITAET
2.3.3.2. WECHSELWIRKUNGEN ZWISCHEN S1- UND S1'-BINDUNGSORT 39
2.3.4. STRUKTURELLE GRUNDLAGEN DER S2'-SPEZIFITAET 42
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.3.5. WECHSELBEZIEHUNGEN ZWISCHEN DEN ST- UND S2'-BINDUNGSORTEN IM 49
TRYPSIN
2.3.5.1. S2'-SPEZIFITAET VON TR'- CH'[L40], TR'- CH'[L60] UND
TR'- CH'[L40+L60] 49
2.3.5.2. MODIFIKATION DER ENZYM-SUBSTRAT-WECHSELWIRKUNGEN MITTELS 51
CHEMISCHER MODIFIZIERUNGEN DES TRYPSINS
2.3 5.3. ST-SPEZIFITAET VON TR- CH[S1+L1+L2+Y172W+E151R] 52
2.3.5.4. S'-SPEZIFITAET VON TR-CH[S1+L1+L2+Y172W+L40+L60+E151R] 54
2.4. KONSTRUKTION EINER VON TRYPSIN ABGELEITETEN SEQUENZSPEZIFISCHEN 56
RESTRIKTIONSENDOPROTEASE
2.4.1. ERWEITERUNG DER TRYPSINSPEZIFITAET AUF DIE S1 '-POSITION 57
2.4.1.1. KONSTRUKTION UND CHARAKTERISIERUNG DER TRYPSINMUTANTEN 58
2.4.1.2. ST-SPEZIFITAET DER MUTANTEN K60E UND K60D 58
2.4.1.3. K60E - EINE RESTRIKTIONSENDOPROTEASE? 60
2.4.1.4. STRUKTURELLE GRUNDLAGEN DER ST-SPEZIFITAET VON K60E 61
(MIT MICHAEL THORMANN)
2.4.1.5. K60E - EINE RESTRIKTIONSEXOPEPTIDASE? 63
2.5. ZUSAMMENFASSUNG 65
3. EXPERIMENTELLER TEIL
3.1. ALLGEMEINE EXPERIMENTELLE BEDINGUNGEN 69
3.2. KONSTRUKTION, EXPRESSION UND REINIGUNG VON TRYPSIN-MUTANTEN 69
3.2.1. MUTAGENESE 69
3.2.2. HEFETRANSFORMATION UND -SELEKTION 70
3.2.3. ISOLIERUNG UND REINIGUNG DER TRYPSINMUTANTEN 71
3.2.4. BESTIMMUNG VON KONZENTRATION UND AKTIVITAET DER TRYPSINMUTANTEN 71
3.3. GUANYLIERUNG VON TRYPSIN UND TRYPSINOGEN 72
3.4. SUCCINYLIERUNG DES TRYPSINS 73
3.5. CD-SPEKTROSKOPIE
74
3.6. BESTIMMUNG ENZYMKINETISCHER PARAMETER
74
3.6.1. FLUORIMETRISCHE BESTIMMUNG
74
3.6.2. SPEKTROPHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG
75
3.6.3. TITRIMETRISCHE BESTIMMUNG
75
3.6.4. HPLC-BESTIMMUNG
76
3.7. ACYLTRANSFEREXPERIMENTE 76
3.7.1. HPLC-ANALYSEN
77
3.8. MOLEKUELMECHANISCHE BERECHNUNGEN 78
LITERATUR
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