Kinetische und biophysikalische Untersuchungen des katalytischen Zentrums und der primären Bindungsstelle von Ribonuklease T1:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1998
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| Beschreibung: | Leipzig, Univ., Diss., 1998 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG.
1.1 RIBONUKLEASEN.
1.2 RIBONUKLEASE TI.
1.2.1 DAS KATALYTISCHE ZENTRUM.
1.2.2 DIE PRIMAERE BINDUNGSSTELLE.
1.2.3 DIE ROLLE DES SINGULAEREN TRYPTOPHANS.
1.2.4 DIE PROTEINSTRUKTUR IN LOESUNG.
1.3 AUFGABENSTELLUNG.
2. MATERIAL.
2.1 BAKTERIENSTAEMME.
2.1.1 ESCHERICHIA COLI DH5AFIQ'.
2.2 VEKTOREN.
2.2.1 PUC 18.
2.2.2 PIN-III-R MPA2.
2.2.3 .
2.3 OLIGONUKLEOTIDE.
2.3.1 PCR-UNIVERSALPRIMER.
2.3.2 MUTAGENESE-PRIMER.
2.4 ENZYME UND PROTEINE.
2.5 ANTIKOERPER.
2.6 DNA-LAENGEN- UND MOLEKULARGEWICHTSSTANDARD.
2.7 MEDIEN.
2.8 PUFFER.
2.9 MATERIALIEN.
2.10 CHEMIKALIEN.
2.11 SOFTWARE.
3. METHODEN.*.
3.1 LABORTECHNISCHE SICHERHEIT.
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN.
3.2.1 WACHSTUM UND TRANSFORMATION VON BAKTERIENZELLEN
3.2.1.1 ANZUCHT VON ESCHERICHIA COLI.
3.2.1.2 HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN.
3.2.1.2.1 SCHNELLE METHODE NACH NISHIMURA.
3.2.1.2.2 METHODE NACH INOUE.
3.2.1.2.3 TRANSFORMATION.
3.2.2 EXTRAKTION UND FAELLUNG VON DNA.
3.2.2.1 PHENOLEXTRAKTION.
.
1
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.II
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.13
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.20
.21
.21
.22
.22
.22
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/953990796
IV
3.2.2.2 ALKOHOL-PRAEZIPITATION.
3.2.3 PLASMID-PRAEPARATION.
3.2.4 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN.
3.2.4.1 STANDARD-REAKTIONSANSATZ.
3.2.5 DNA-LIGATION.
3.2.6 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE.
3.2.7 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSE-GELEN.
3.2.7.1 ISOLIERUNG DURCH ELEKTROELUTION.
3.2.7.2 ISOLIERUNG MIT DEAE-MEMBRANEN.
3.2.8 DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG.
3.2.9 OLIGONUKLEOTID-DIRIGIERTE MUTAGENESE NACH LANDT
ET AL. (1990).
3.2.9.1 MUTAGENESEREAKTION.
3.2.9.1.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION.
3.2.9.1.2 REINIGUNG DES PCR-ZWISCHENPRODUKTES.
3.2.9.1.3 POLYMERASE-KETTENREAKTION.
3.2.9.1.4 REINIGUNG DES PCR-PRODUKTES.
3.2.10 DETEKTION VON RNASE SEKRETIERENDEN
E. COLI-KOLONIEN.
3.2.11 DNA-SEQUENZANALYSE.
3.2.11.1 SEQUENZIERUNGSREAKTION.
3.2.11.2 DENATURIERENDE GELELEKTROPHORESE.
3.3 PROTEINCHEMISCHE METHODEN.
3.3.1 EXPRESSION UND PERIPLASMA-PRAEPARATION NACH LANDT ET AL. (1992).
3.3.2 IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE.
3.3.3 GELFILTRATIONSCHROMATOGRAPHIE.
3.3.4 ANALYTISCHE FPLC.
3.3.5 MODIFIKATIONEN DER STANDARDREINIGUNG.
3.3.6 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.
3.3.6.1 LOESUNGEN FUER DISKONTINUIERLICHE SDS-PAGE NACH LAEMMLI (1970).
3.3.6.2 LOESUNGEN FUER DISKONTINUIERLICHE SDS-PAGE NACH SCHAGGER & VON
JAGOW (1987)
3.3.7 FAERBUNG DER PROTEINE.
3.3.7.1 COOMASSIE BRILLIANT BLUE FAERBUNG.
3.3.7.2 SILBERFAERBUNG NACH HEUKESHOVEN & DERNICK (1988).
3.3.8 IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS DURCH WESTERN-BLOTTING.
3.3.8.1 DOT-BLOT.
3.3.8.2 SEMIDRY-BLOTTING NACH TOWBIN ET AL. (1979).
3.3.8.3 ENTWICKLUNG DES BLOTS.
3.3.9 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION.
3.3.10 FLUORESZENZMARKIERUNG VON S35C.
3.4 ENZYMKINETISCHE METHODEN.
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23
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25
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YY32
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.36
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.37
.38
.38
.39
YY.39
.40
.41
V
3.4.1 MICHAELIS-MENTEN-KINETIK.
3.4.1.1 UMESTERUNG VON GUANYLYL-3\5'-CYTIDIN (GPC).
3.4.1.2 RNA-HYDROLYSE.
3.5 BIOPHYSIKALISCHE METHODEN.
3.5.1 FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE.
3.5.1.1 STATIONAERE FLUORESZENZ.
3.5.1.2 FLUORESZENZQUENCHING-TITRATIONEN.
3.5.1.3 ZEITAUFGELOESTE FLUORESZENZ.
3.5.1.4 RESONANZENERGIETRANSFER.
3.5.1.5 FLUORESZENZ-KORRELATIONS-SPEKTROSKOPIE.
3.5.2 SLOPPED-FLOW-MESSUNGEN.
3.5.2.1 BESTIMMUNG DER GESCHWINDIGKEITSKONSTANTEN DER BINDUNG VON 2'GMP
UND WT RNASE TI UND
VARIANTEN.
3.5.2.2 VERDRAENGUNG MIT GPC.
4. ERGEBNISSE.
4.1 OLIGONUKLEOTID-DIRIGIERTE MUTAGENESE.
4.2 PROTEINREINIGUNG.
4.2.1 STABILE VARIANTEN.
4.2.2 DIE VARIANTEN S35C UND S35C-1.5-IAEDANS.
4.2.3 INSTABILE VARIANTE H40D/H92D.
4.2.3.1 MODIFIZIERTE PROTEINREINIGUNG.
4.2.3.2 AKTIVITAETSABSCHAETZUNG DER VARIANTE H40D/H92D.
4.3 KINETISCHE CHARAKTERISIERUNG.
4.3.1 BESTIMMUNG DER MICHAELIS-MENTEN-KONSTANTEN.
4.4 FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE.
4.4.1
FLUORESZENZ-KORRELATIONS-SPEKTROSKOPIE (FCS).
4.4.2 STATIONAERE FLUORESZENZ.
4.4.2.1 VARIANTE S35C-1.5-IAEDANS.
4.4.2.2 TYR/TRP-AUSTAUSCHVARIANTEN.
4.4.3 BESTIMMUNG DER RELATIVEN QUANTENAUSBEUTE.
4.4.4 FLUORESZENZQUENCHING-TITRATION.
4.4.5 STOPPED-FLOW-MESSUNGEN.
4.4.5.1 BESTIMMUNG DER GESCHWINDIGKEITSKONSTANTEN DER BINDUNG VON 2'GMP
AN RNASE TI.
4.4.5.2 VERDRAENGUNG DURCH GPC.
4.4.6 ZEITAUFGELOESTE FLUORESZENZ.
4.4.7 ABSTANDSBESTIMMUNG DER TRYPTOPHANYLRESTE.
5. DISKUSSION.
5.1 DAS KATALYTISCHE ZENTRUM VON RIBONUKLEASE TI.
5.1.1 OLIGONUKLEOTID-DIRIGIERTE MUTAGENESE NACH LANDT.
41
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43
43
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.58
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.60
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.62
.63
.63
.63
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.67
.67
.69
.71
.73
.75
.75
.75
VI
5.1.2 ISOLIERUNG DER VARIANTE H40D/H92D.76
5.1.3 DIE KATALYTISCHE AKTIVITAET DER VERSCHIEDENEN VARIANTEN VON H40X,
H92X.78
5.1.4 DIE BEDEUTUNG VON HIS40 UND HIS92 FUER KATALYSE UND STABILITAET VON
WT RNASE TI.79
5.1.5 DIE ROLLE DER GELADENEN SEITENKETTEN IM KATALYTISCHEN ZENTRUM.9
5.2 DIE PRIMAERE BINDUNGSSTELLE VON RNASE TI.^2
5.2.1 DIE DISSOZIATIONSKONSTANTEN VON 2'GMP FUER WT RNASE TI UND DIE
TRP/TYR-VARIANTEN.82
5.2.1.1 FLUORESZENZQUENCHING-TITRATION.
5.2.1.2 STOPPED-FLOW-MESSUNGEN.
5.2.1.2.1 DIE GESCHWINDIGKEITSKONSTANTEN DER BINDUNG VON 2'GMP UND WT
RNASE TI UND DIE TYR/TRP-
VARIANTEN.
5.2.1.3 VERGLEICH DER MESSMETHODEN.^6
5.2.1.4 BEZIEHUNG ZWISCHEN K
D UND K,N FUER WT RNASE TI UND DIE TYR/TRP-VARIANTEN.90
5.2.1.5 DIE BINDUNG VON RNA-OLIGOMEREN.
94
5.2.2 DIE GEOMETRIE DER BINDUNGSSTELLE IN LOESUNG.
5.2.2.1 DIE STATIONAERE FLUORESZENZ VON RNASE TI UND DEN
TYR/TRP-VARIANTEN.
5.2.2.2 ZEITAUFGELOESTE FLUORESZENZ.
5.2.2.2.1 ABKLINGFUNKTION FUER WT RNASETL.
5.22.2.2
ABKLINGFUNKTIONEN FUER DIE VARIANTEN Y24W/W59Y, Y42W/W59Y UND Y45W/W59Y.
5.2.2.2.3 DIE ABKLINGKURVEN DER VARIANTEN Y24W, Y42W UND Y45W.
5.2.2.2.4 ABSTAENDE ZWISCHEN AUSGEWAEHLTEN AMINOSAEURESEITENKETTEN.
5.2.2.2.5 AUSWIRKUNGEN AUF DIE KATALYSE.
5.2.3 SCHLUSSFOLGERUNGEN.
5.3 AUSBLICK.
.95
.98
YY98
YY99
100
101
.
102
.103
.104
6. ZUSAMMENFASSUNG.
7. LITERATURVERZEICHNIS.
8. ANHANG.
8.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.
8.2 NOMENKLATUR DER AMINOSAEUREN UND VARIANTEN
8.2.1 AMINOSAEUREN.
8.2.2 VARIANTEN.
105
107
,123
.123
.125
YY125
YY125
YY126
8.3 NOMENKLATUR DER BASEN IN NUKLEINSAEUREN
8.4 ABKUERZUNGEN DER RIBONUKLEASEN.
126 |
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