Herstellung von Interleukin-4 Rezeptor alpha defizienten Mäusen unter Verwendung des cre-loxP Systems und deren phänotypische Analyse:
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INHALTSVERZEICHNIS
I
ABKUERZUNGEN V-VI
ABBILDUNGSVERZEICHNIS VII
1 .EINLEITUNG_
1-13
1.1. DAS IMMUNSYSTEM: SELBST ODER NICHT-SELBST, DAS IST HIER DIE FRAGE 1
1.2. DIE UNSPEZIFISCHE (ANGEBORENE) IMMUNITAET 1
1.3. DIE SPEZIFISCHE IMMUNITAET 2
1.4. ZYTOKINE: BOTENSTOFFE DES IMMUNSYSTEMS 3
1.5. DIE T-HELFER DICHOTOMIE 4
1.6. INTERLEUKIN-4, INTERLEUKIN-13 UND SEINE REZEPTOREN 6
1.7. EVOLUTION EINER REVOLUTION - DIE NAECHSTE GENERATION VON KNOCKOUT
MAEUSEN 9
1.8. ZIELSETZUNG DER ARBEIT 13
2 . ERGEBNISSE
_ 14-49
2.1. KLONIERUNG DES ZIELKONSTRUKTES ZUR HOMOLOGEN REKOMBINATION DES 14
IL-4RA GENS
2.1.1. KLONIERUNGSSTRATEGIE 14
2.1.2. KLONIERUNG DES KONTROLL- UND ZIELKONSTRUKTES 15
2.1.3. ETABLIERUNG DER ZIEL-PCR 18
2.2. HERSTELLUNG VON BALB/C MAEUSEN MIT EINEM MUTIERTEN IL-4ROC GEN 19
2.2.1. MANIPULATION DES IL-4RA-LOCUS IN ES-ZELLEN MITTELS HOMOLOGER 19
REKOMBINATION
2.2.2. MANIPULATION DES MODIFIZIERTEN IL-4RA-LOCUS IN ES-ZELLEN MITTELS
21
ORTSSPEZIFISCHER REKOMBINATION
2.2.3. BLASTOZYSTENINJEKTION UND DIE HERSTELLUNG VON KEIMBAHNCHIMAEREN 25
2.3 ANALYSE IL-4RA DEFIZIENTER MAEUSE 27
2.3.1. NORMALE ENTWICKLUNG IYMPHOIDER ZELLEN IN IL-4ROC DEFIZIENTEN
MAEUSEN 27
2.3.2. VERLUST DER IL-4 INDUZIERTEN GENEXPRESSION IN IL-4RA DEFIZIENTEN
ZELLEN 27
2.3.3. VERLUST DER IL-4 INDUZIERTEN PROLIFERATION IN IL-4RA DEFIZIENTEN
LYMPHOZYTEN 28
2.3.4. VERLUST VON IL-4 UND IL-13 VERMITTELTEN FUNKTIONEN IN IL-4RA'/'
MAKROPHAGEN 30
2.3.5. BEEINTRAECHTIGUNG DER TH2 DIFFERENZIERUNG IN IL-4RAA CD4+ ZELLEN
31
2.4. INFEKTIONSSTUDIEN MIT IL-4RA'A UND IL-4RA,LOX/NOX MAEUSEN 33
2.4.1. INFEKTION MIT
NIPPOSTRONGYLUS BRASILIENSIS: IL-4RA DEFIZIENTE MAEUSE ZEIGEN 33
EINE STARKE BEEINTRAECHTIGUNG VON TH2 EFFEKTORFUNKTIONEN
2.4.2. INFEKTION MIT
L MAJOR. RESISTENZ ODER SUSZEPTIBILITAET? 35
2.4.2.1. DIE FRUEHE INDUKTION VON IL-4 NACH EINER INFEKTION MIT
L MAJOR IST IN IL-4RA/' 36
MAEUSEN NICHT BEEINTRAECHTIGT
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/953858596
INHALTSVERZEICHNIS
II
2.4.2.2. KLINISCHER VERLAUF EINER INFEKTION MIT
L MAJOR. KONTROLLE STATT HEILUNG 37
2.4.2.3. PARASITENBELASTUNG DER DRAINIERENDEN LYMPHKNOTEN: KEINE
EFFIZIENTE 39
ELIMINIERUNG DER PARASITEN
2.4.2.4. RESTIMULIERUNG DER DRAINIERENDEN LYMPHKNOTENZELLEN NACH
INFEKTION MIT 40
L. MAJOR
2.4.2.5. QUANTIFIZIERUNG DER GENEXPRESSION CD4
+ ZELLEN MITTELS RT-PCR 42
2.4.2.6. BEEINTRAECHTIGUNG DER EFFEKTORFUNKTIONEN VON IL-4RA DEFIZIENTEN
MAEUSEN NACH 44
INFEKTION MIT L. MAJOR
2.4.2.7. KLINISCHER VERLAUF EINER INFEKTION MIT
L. MAJOR IN LANGZEITSTUDIEN 46
3 .DISKUSSION
_5Q-6Q
3.1. IL^ROC'' VERSUS IL-4'
/_: ZWEI WEGE ZUM GLEICHEN ZIEL? 50
3.2. IL-4RA: EIN REZEPTOR FUER ZWEI ZYTOKINE 50
3.3.
IN VITRO HAENGT EINE TH2 DIFFERENZIERUNG VON IL-4 AB 51
3.4.
IN VIVO VERITAS: INFEKTIONSSTUDIEN AN IL-4ROC DEFIZIENTEN MAEUSEN 52
3.4.1. INFEKTIONSSTUDIEN MIT
N. BRASILIENSIS: TYP 2 EFFEKTORFUNKTIONEN HAENGEN VON 52
IL-4 AB
3.4.2. INFEKTION MIT
L. MAJOR: SUSZEPTIBILITAET ODER RESISTENZ? KONTROLLE! 53
3.4.3. TH2 DIFFERENZIERUNG OHNE IL-4 VERMITTELTE FUNKTIONEN? 55
3.4.4. WELCHE FAKTOREN KOENNEN IN DER ABWESENHEIT VON IL-4 FUNKTIONEN ZU
EINEM 57
TH2 PHAENOTYP FUEHREN?
3.4.5. DIE ABWESENHEIT VON IL-4 FUNKTIONEN FUEHRT BEI EINER INFEKTION MIT
L MAJOR 58
ZU IFN-Y INDUZIERTEN TYP 1 EFFEKTORFUNKTIONEN
3.4.6. VERLUST DER KONTROLLE EINER INFEKTION MIT
L. MAJOR IN IL-4RA DEFIZIENTEN 58
MAEUSEN
3.5. KONDITIONALE INAKTIVIERUNG DES IL-4ROC 59
3.6. ZUSAMMENFASSUNG 60
4 .MATERIAL
_61-69
4.1. VERBRAUCHSMATERIAL 61
4.2. CHEMIKALIEN 61
4.3. RADIOAKTIVITAET 61
4.4. ENZYME UND PROTEINE 61
4.5. ANTIKOERPER 61
4.6. BAKTERIENSTAEMME 62
4.7. ZELLINIEN 63
4.8. MAEUSESTAEMME 63
INHALTSVERZEICHNIS
III
4.9. PLASMIDE 63
4.10. GROESSENSTANDARDS FUER DNA-GELE 63
4.11. OLIGONUKLEOTIDE 64
4.12. PUFFER UND LOESUNGEN 65-69
4.12.1. PUFFER UND LOESUNGEN FUER MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 65-66
4.12.2. PUFFER UND LOESUNGEN FUER ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 66-67
4.12.3 PUFFER UND LOESUNGEN FUER DIE ARBEIT MIT PROTEINEN 67-68
4.13. MEDIEN 68-69
5 .METHODEN
_70-96
5.1. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 70
5.1.1. HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER BAKTERIEN
(CALCIUMCHLORID-METHODE) 70
5.1.2. TRANSFORMATION VON BAKTERIEN 70
5.1.3. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA IM ANALYTISCHEN MASSSTAB (MINI-PRAEP) 71
5.1.4. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA IM PRAEPARATIVEN MASSSTAB (MAXI-PRAEP) 71
5.1.5. PRAEPARATION VON GENOMISCHER DNA AUS GEWEBEKULTURZELLEN 72
5.1.6. PRAEPARATION VON GENOMISCHER DNA AUS GEWEBEBIOPSIEN VON MAEUSEN 72
5.1.7. REINIGUNG VON DNA DURCH EXTRAKTION MIT PHENOL/CHLOROFORM 7 2
5.1.8. PRAEZIPITATION VON DNA 7 3
5.1.9. BESTIMMUNG DER DNA KONZENTRATION 73
5.1.10. HYDROLYTISCHE SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 73
5.1.11. ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA IN AGAROSEGELEN 74
5.1.12. ISOLIERUNG VON GELELEKTROPHORETISCH AUFGETRENNTEN DNA-FRAGMENTEN
75
5.1.13. AUFFUELLEN VON 5 '-UEBERHAENGEN MIT DEM GROSSEN FRAGMENT
(KLENOW-FRAGMENT) 75
DER POLYMERASE I
5.1.14. DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN MIT ALKALISCHER
PHOSPHATASE (CIP) 76
5.1.15. LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN MIT T4-LIGASE 76
5.1.16. HYBRIDISIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN 77
5.1.17. KAPILLARTRANSFER VON DNA AUF NYLONMEMBRAN (SOUTHEM-BLOT) 77
5.1.18. RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 78
5.1.19. HYBRIDISIERUNG MEMBRANGEBUNDENER DNA-FRAGMENTE MIT RADIOAKTIV 78
MARKIERTEN DNA-SONDEN
5.1.20. DNA-SEQUENZIERUNG NACH DER DIDESOXYNUKLEOTID METHODE 78
5.1.21. POLYMERASE-KETTENREAKTION (POLYMERASE CHAIN REACTION, PCR) 79
5.1.22. ISOLIERUNG ZELLULAERER RNA 80
5.1.23. REVERSE TRANSKRIPTION 81
5.1.24. KOMPETITIVE RT-PCR 82
5.2. MIKROBIOLOGISCHE- UND ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 83
INHALTSVERZEICHNIS
IV
5.2.1. KRYOKONSERVIERUNG VON BAKTERIENKULTUREN 83
5.2.2. KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN 83
5.2.3. PASSAGE VON ADHAERENTEN ZELLEN 83
5.2.4. PRAEPARATION, KULTIVIERUNG UND INAKTIVIERUNG VON EMBRYONALEN
FIBROBLASTEN 83
5.2.5. KULTIVIERUNG VON EMBRYONALEN S TAMMZELLEN 84
5.2.6. TRANSFEKTION VON ES-ZELLEN 85
5.2.7. SELEKTION VON ES-ZELLEN 85
5.2.8. ISOLIERUNG EINZELNER ES-ZELLKLONE UND AUFARBEITUNG FUER DIE
PCR-ANALYSE 86
5.2.9. BLASTOZYSTEN-INJEKTION UND REIMPLANTATION VON BLASTOZYSTEN 87
5.3. METHODEN ZUR PRAEPARATION UND ANALYSE VON ZELLEN AUS MAEUSEN 88
5.3.1. PRAEPARATION VON ORGANEN 88
5.3.2. BLUTENTNAHME VON MAEUSEN ZUR SERENGEWINNUNG UND
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHEN 88
ANALYSE
5.3.3. ERYTHROZYTENLYSE 8 8
5.3.4. DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSE VON ZELLEN 89
5.3.5. ANREICHERUNG CD4
+ ZELLEN MITTELS FLUORESZENZ-AKTIVIERTER ZELLSORTIERUNG 90
(FACSORT)
5.3.6. ANREICHERUNG CD4
+ ZELLEN MITTELS AN MAGNETISCHE PARTIKEL GEBUNDENER 90
ANTIKOERPER
5.3.7. IN VITRO DIFFERENZIERUNG CD4
+ ZELLEN 90
5.3.8. IN VITRO STIMULIERUNG VON ZELLEN DER MILZ 91
5.3.9. PROLIFERATIONSSTUDIEN 91
5.3.10. NO PRODUKTION PERITONEALER MAKROPHAGEN 91
5.3.11. BESTIMMUNG DER NO KONZENTRATION MITTELS DER GRIESS REAKTION 92
5.4. PARASITEN UND INFEKTION VON MAEUSEN 92
5.4.1.
LEISHMANIA MAJOR 92
5.4.2. KULTIVIERUNG VON
L. MAJOR 92
5.4.3. INFEKTION VON MAEUSEN MIT
L. MAJOR 93
5.4.4. QUANTITATIVE KULTUR VON
L. MAJOR 94
5.4.5. HERSTELLUNG VON
L. MAJOR ANTIGENEN 94
5.5. NACHWEIS VON FESTPHASENGEBUNDENEN ANTIGENEN IM ENZYM-GEKOPPELTEN-
94
IMMUNTEST (ELISA)
5.6. HISTOLOGIE 96
5.7. STATISTISCHE AUSWERTUNG 96
6 . LITERATURVERZEICHNIS_97-105
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF |
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