Zelluläre Testsysteme zur pharmakologischen Charakterisierung neuer Neuropeptid-Y-Rezeptorantagonisten: Rezeptor-Bindungsstudien und funktionelle Untersuchungen zur Calciummobilisierung und cAMP-Bildung
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ZELLULAERE TESTSYSTEME ZUR PHARMAKOIOGISCHEN
CHARAKTERISIERUNG NEUER NEUROPEPTID Y-REZEPTORANTAGONISTEN:
REZEPTOR-BINDUNGSSTUDIEN UND FUNKTIONEILE UNTERSUCHUNGEN
ZUR CALCIUMMOBILISIERUNG UND CAMP-BILDUNG
DISSERTATION
- ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES
DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)
DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET IV
- CHEMIE UND PHARMAZIE - DER UNIVERSITAET REGENSBURG
VORGELEGT VON
KARIN GESSELE
AUS MOOSBURG A.D. ISAR
1998
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG 1
1.1 STRUKTUR VON NPY 2
1.2 LOKALISATION VON NPY 3
1.3 PERIPHERE UND ZENTRALE WIRKUNGEN VON NPY 3
1.4 NPY-REZEPTORSUBTYPEN 5
1.4.1 DER YPREZEPTOR 6
1.4.2 DER Y 2 -REZEPTOR 10
1.4.3 DER Y 3 -REZEPTOR 11
1.4.4 DER Y 4 - BZW. PPI-REZEPTOR 12
1.4.5 DER Y 5 -REZEPTOR (FEEDING-REZEPTOR?) 12
1.4.6 DER Y6-REZEPTOR 13
1.4.7 WEITERE REZEPTORSUBTYPEN 13
1.5 NPY-REZEPTORANTAGONISTEN 14
1.6 TESTMODELLE ZUR CHARAKTERISIERUNG VON WIRKSTOFFEN 16
1.7 TESTMODELLE FUER NPY-REZEPTOR-LIGANDEN 18
1.7.1 RADIOLIGAND-BINDUNGSSTUDIEN 18
1.7.2 FUNKTIONELLE TESTMODELLE AN ZELLKULTUREN 20
1.7.3 FUNKTIONELLE TESTMODELLE AM ISOLIERTEN ORGAN 21
1.7.4 IN-VIVO-MODELLE 22
1.8 PROBLEMSTELLUNG 23
2 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 25
2.1 RADIOLIGAND-BINDUNGSSTUDIEN ZUR TESTUNG VON NPY-ANTAGONISTEN 25
2.1.1 EINLEITUNG 25
2.1.2 WAHL DES GEEIGNETEN RADIOLIGANDEN 27
2.1.3 UEBERPRUEFUNG DER BIOLOGISCHEN AKTIVITAET VON MARKIERTEN LIGANDEN 29
2.1.3.1 PROPIONYLIERUNG VON HNPY 29
2.1.3.2 BOLTON-HUNTER-MARKIERUNG VON NPY 31
2.1.3.3 BIOLOGISCHE TESTUNG DER DERIVATE 32
2.1.4 SPEZIELLE PROBLEME BEI PEPTIDLIGANDEN 33
2.1.5 AUSWAHL DER REZEPTORQUELLE 35
IMAGE 3
2.1.6 BESTIMMUNG DER UNSPEZIFISCHEN BINDUNG 39
2.1.7 OPTIMIERUNG DER INKUBATIONSBEDINGUNGEN 39
2.1.7.1 AUSWAHL DES GEEIGNETEN PUFFERS 39
2.1.7.2 ASSOZIATIONS-UND DISSOZIATIONSKINETIK 40
2.1.7.3 TRENNUNG VON GEBUNDENEM UND FREIEM LIGANDEN 44
2.1.7.4 ERMITTLUNG DER OPTIMALEN REZEPTORKONZENTRATION IM TEST 45
2.1.8 SAETTIGUNGSEXPERIMENTE 47
2.1.9 PHARMAKOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DER TESTMODELLE 50
2.2 EXPRESSION DES NPY Y 2 -REZEPTORS 54
2.2.1 EINLEITUNG 54
2.2.2 AUSWAHL DER GEEIGNETEN ZELLINIE 55
2.2.3 TESTUNG VON PEPTIDEN .....57
2.3 BESTIMMUNG DER NPY YI-ANTAGONISTISCBEN WIRKUNG IM CA 2+ -ASSAY 59
2.3.1 EINLEITUNG .^ 59
2.3.2 BESTIMMUNG DER INTRAZELLULAEREN CA 2+ -KONZENTRATION 60
2.3.3 ERMITTLUNG DER VERSUCHSPARAMETER ZUR TESTUNG VON NPY-ANTAGONISTEN
64
2.3.3.1 ZELLDICHTE DER HEL-SUSPENSIONSKULTUREN 64
2.3.3.2 INKUBATIONSBEDINGUNGEN 65
2.3.3.3 ERMITTLUNG DER TESTPARAMETER 69
2.3.4 UNTERSUCHUNGEN ZUM MECHANISMUS DES NPY-INDUZIERTEN CA 2+ -SIGNALS
71
2.3.5 UEBERPRUEFUNG DES TESTMODELLS 76
2.4 BESTIMMUNG DER NPY YI-ANTAGONISTISCHEN WIRKUNG IM CAMP-ASSAY 79
2.4.1 EINLEITUNG 79
2.4.2 PRINZIP DER TESTUNG VON YI-ANTAGONISTEN IM CAMP-ASSAY 79
2.4.3 PRINZIP DER CAMP-BESTIMMUNG 80
2.4.4 ERMITTLUNG DER VERSUCHSPARAMETER ZUR CAMP-BESTIMMUNG 82
2.4.5 ERMITTLUNG DER OPTIMALEN PARAMETER ZUR TESTUNG VON
NPY-ANTAGONISTEN 84
2.5 BESTIMMUNG DER THROMBININHIBITORISCHEN WIRKUNG IM CA 2+ -ASSAY 91
2.5.1 EINLEITUNG : . 91
2.5.2 THROMBIN-VERMITTELTER CA 2+ -ANSTIEG IN HEL-ZELLEN 93
2.6 PHARMAKOLOGISCHE TESTUNG VON SUBSTANZEN 98
2.6.1 STRUKTURKLASSE I: PHENYL(PYRIDYL)ALKYL- UND
BENZYL(PYRIDYL)AMINOALKYL-GUANIDINE...98
2.6.2 STRUKTURKLASSE II: AMINO- UND GUANIDINOALKANAMIDE 101
2.6.3 STRUKTURKLASSE III: DIPHENYLALKANOYLARGININAMIDE 103
2.6.4 SONSTIGE VERBINDUNGEN 106
2.6.5 KORRELATION DER TESTERGEBNISSE 108
2.6.6 DISKUSSION DER PHARMAKOIOGISCHEN TESTERGEBNISSE 111
3 ZUSAMMENFASSUNG 115
4 EXPERIMENTELLER TEIL 119
4.1 ALLGEMEINES 119
4.1.1 TESTSUBSTANZEN 119
4.1.2 GERAETE 119
4.1.3 STRUKTURANALYTIK 120
4.1.4 VERBRAUCHSMATERIAL UND CHEMIKALIEN 120
4.2 ZELLKULTUR 121
4.2.1 REAGENZIEN 121
4.2.2 ZELLINIEN : 121
4.2.3 KULTURBEDINGUNGEN 122
4.3 SYNTHESE VON NPY-DERIVATEN 123
4.3.1 HPLC-REINIGUNG VON HNPY (ROHPRODUKT) UND DEN DERIVATISIERTEN
PEPTIDEN 123
4.3.2 SYNTHESEVORSCHRIFTEN 124
4.3.3 GEHALTSBESTIMMUNG DER PEPTIDE 126
4.4 YI- UND Y 2 - RADIOLIGAND-BINDUNGSASSAY 127
4.4.1 REAGENZIEN 127
4.4.2 MEMBRANPRAEPARATION FUER DEN Y 2 -TEST 129
4.4.3 YI-BINDUNGSASSAY MIT INTAKTEN SK-N-MC-ZELLEN 130
4.4.4 Y 2 -BINDUNGSASSAY AN SMS-KAN-MEMBRANEN 131
4.5 TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE 132
4.5.1 BAKTERIENMEDIEN UND REAGENZIEN 132
4.5.2 TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN E. COLI 134
4.5.3 PLASMID-DNA MINI, MIDI- UND MAXIPRAEPARATION 135
4.5.4 DNA-KONZENTRATIONS- UND REINHEITSBESTIMMUNG 136
4.5.5 RESTRIKTIONSVERDAU 136
IMAGE 4
4.5.6 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 136
4.5.7 TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE 137
4.5.8 RADIOLIGAND-BINDUNGSASSAY AN TRANSIENT TRANSFIZIERTEN ZELLEN 137
4.6 BESTIMMUNG DER INTRAZELLULAEREN CA 2+-KONZENTRATION IN HEL-ZELLEN 138
4.6.1 REAGENZIEN 138
4.6.2 GERAETEEINSTELLUNG 139
4.6.3 VORBEREITUNG DER ZELLEN 140
4.6.4 SCREENING VON NPY-ANTAGONISTEN . 140
4.6.5 AUFNAHME VON KONZENTRATIONS-WIRKUNGS-KURVEN VON NPY, NPY-DERIVATEN
UND
PYY SOWIE BESTIMMUNG VON PKE-WERTEN 141
4.6.6 BESTIMMUNG DER THROMBIN-INHIBITORISCHEN WIRKUNG 141
4.6.7 KALIBRIERUNG UND BERECHNUNG DES [CA 2+]J-ANSTIEGS 141
4.7 BESTIMMUNG VON 3 ,5 -CAMP IN ZELLEN 142
4.7.1 REAGENZIEN : 142
4.7.2 PROBENVORBEREITUNG 146
4.7.3 PROBENAUFBEREITUNG ....147
4.7.4 BESTIMMUNG DES CAMP-GEHALTES 147
4.7.5 GERAETEEINSTELLUNG 148
4.7.6 BERECHNUNG DES CAMP-GEHALTES 149
4.8 AUSWERTUNG DER EXPERIMENTELLEN DATEN 150
4.8.1 ABKUERZUNGEN 150
4.8.2 BERECHNUNG VON KD-WERTEN AUS SAETTIGUNGSEXPERIMENTEN
(RADIOLIGAND-BINDUNG) .151
4.8.3 BERECHNUNG VON IC50-WERTEN AUS KOMPETITIONSKURVEN IM RADIOLIGAND-
BINDUNGSASSAY 151
4.8.4 BERECHNUNG VON EC50-WERTEN AUS KONZENTRATIONS-WIRKUNGS-KURVEN 151
4.8.5 BERECHNUNG VON IC50-WERTEN FUER DIE ANTAGONISTISCHE WIRKUNG IM CA
2+- UND IM
CAMP-ASSAY 152
4.8.6 BESTIMMUNG VON PKE-WERTEN 153
4.8.7 BESTIMMUNG DES PA 2-WERTES 154
5 LITERATURVERZEICHNIS 155
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| spelling | Geßele, Karin Verfasser aut Zelluläre Testsysteme zur pharmakologischen Charakterisierung neuer Neuropeptid-Y-Rezeptorantagonisten Rezeptor-Bindungsstudien und funktionelle Untersuchungen zur Calciummobilisierung und cAMP-Bildung vorgelegt von Karin Geßele 1998 168 S. graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Regensburg, Univ., Diss., 1998 Neuropeptid Y (DE-588)4317370-6 gnd rswk-swf Calcium (DE-588)4069806-3 gnd rswk-swf Mobilisierung Medizin (DE-588)4253440-9 gnd rswk-swf Cyclo-AMP (DE-588)4148493-9 gnd rswk-swf In-vitro-Kultur (DE-588)4332883-0 gnd rswk-swf Wirkstoff-Rezeptor-Bindung (DE-588)4190019-4 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Neuropeptid Y (DE-588)4317370-6 s Cyclo-AMP (DE-588)4148493-9 s In-vitro-Kultur (DE-588)4332883-0 s DE-604 Wirkstoff-Rezeptor-Bindung (DE-588)4190019-4 s Calcium (DE-588)4069806-3 s Mobilisierung Medizin (DE-588)4253440-9 s GBV Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=008181411&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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