HPLC-Analyse anaerober Bakterien: Untersuchungen zur schnellen Identifizierung humanpathogener strikt anaerober Bakterien mit Hilfe der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)
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Kiel
Schmidt & Klaunig
1998
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1. EINLEITUNG 1
1.1 Mikrobiologie anaerober Bakterien 1
1.2 Ökologie und medizinische Bedeutung humanpathogener Anaerobier
(normales Vorkommen, klinische Bedeutung, Virulenzfaktoren) 3
1.2.1 Gramnegative anaerobe Stäbchenbakterien (Bacteroides, Prevotella, Porphyro
monas, Megamonas, Mitsuokella, Rikenella, Tissierella, Fusobacterium) 5
1.2.1.1 Bacteroides 6
1.2.1.2 Prevotella 8
1.2.1.3 Porphyromonas 9
1.2.1.4 Megamonas, Mitsuokella, Rikenella, Tissierella 9
1.2.1.5 Fusobacterium 10
1.2.2 Grampositive nicht sporenbildende anaerobe Stäbchenbakterien
(Bifidobacterium, Propionibacterium, Eubacterium, Lactobacillus) 11
1.2.2.1 Bifidobacterium 11
1.2.2.2 Propionibacterium 12
1.2.2.3 Eubacterium 13
1.2.2.4 Lactobacillus 13
1.2.3 Grampositive sporenbildende anaerobe Bakterien des Genus Clostridium 14
1.2.3.1 Clostridium perfringens und andere histotoxische sowie sonstige
Clostridium Arten 15
1.2.3.2 Clostridium botulinum 17
1.2.3.3 Clostridium tetani 17
1.2.3.4 Clostridium difßcile 18
1.2.4 Obligat anaerobe Kokken 19
1.2.4.1 Grampositive Kokken (Peptococcus I Peptostreptococcus) 19
1.2.4.2 Gramnegative Kokken (Veillonella) 20
1.3 Mikrobiologische Diagnostik anaerober Bakterien 20
1.3.1 Methoden zur Identifizierung von Anaerobiern 22
1.3.2 HPLC Methode 27
2. ZIELSETZUNG und FRAGESTELLUNGEN 28
3. MATERIAL UND METHODE 30
3.1 Verwendete anaerobe Bakterien 30
3.1.1 Referenzstämme 30
3.1.2 Wildstämme 30
3.2.3 Neue Taxonomie anaerober Bakterien 34
3.3 Biochemische Identifizierung der Isolate 37
3.3.1 Identifizierung von Anaerobiern mit dem ATB 32A System 37
3.3.2 Identifizierung der Anaerobier mit dem Rapid ID 32A System 38
3.4 Nährmedien und Chemikalien 41
3.4.1 Nährmedien 41
3.4.2 Chemikalien 42
3.5 HPLC Gerät und Säulenmaterial 42
3.6 Kulturen und Probenvorbereitung für die Säure Analyse 44
3.6.1 Kulturen 44
3.6.2 Probenvorbereitung 45
3.6.3 Hemmung des Bakterienwachstums durch Zusatz von H2SO4 48
3.7 HPLC Analyse flüchtiger (FS) und nicht flüchtiger (NFS) kurzkettiger Säuren 48
3.7.1 Herstellung der für die HPLC Analyse verwendeten Fließmittel (FM) 51
3.7.2 Verwendung verschiedener organischer Lösungsmittel für die Extraktion
kurzkettiger Säuren 52
3.7.3 Einfluß der Temperatur und der Zusammensetzung des Fließmittels auf die
Trennleistung und Auflösung der kurzkettigen Säuren 52
3.8 Standard mit flüchtigen (FS) und nicht flüchtigen (NFS) kurzkettigen Säuren 53
3.8.1 Herstellung der Standards mit Referenzsäuren 54
3.8.2 Haltbarkeit der FS und NFS nach Extraktion mit Äther 59
3.8.3 Bestimmung der Wiederfindungsrate und Reproduzierbarkeit kurzkettiger
FS und NFS 59
3.9 Qualitative und quantitative Auswertung der FS und NFS von Anaerobiern
in Kulturmedium 60
3.10 Einfluß der Bebrütungs und Extraktionszeit auf den Nachweis von
kurzkettigen Säuren in anaeroben Bakterienkulturen 62
3.11 Statistische Methoden 63
3.11.1 Rechnereinheit und Statistikprogramm 63
4. ERGEBNISSE 65
4.1 Biochemische Identifizierung der Isolate 65
4.1.1 Identifizierung anaerober Bakterien Stämme mit dem ATB 32A System
(BioMerieux) 65
4.1.2 Identifizierung anaerober Bakterien Stämme mit dem Rapid ID 32A System 66
4.2 HPLC Methode zum Nachweis flüchtiger (FS) und nichtflüchtiger (NFS) Säuren 72
4.2.1 HPLC Analyse der Referenzsäuren 73
4.2.2 Wiederfindungsrate und Reproduzierbarkeit 78
4.2.3 HPLC Analyse der Schaedler Bouillon 86
4.3 Einfluß verschiedener Faktoren auf die Analyse von kurzkettigen Säuren 87
4.3.1 Temperatur und Zusammensetzung des Fließmittels 87
4.3.2 Extraktionsverfahren 89
4.3.3 Einfluß der Bebrütungs und Extraktionszeit auf die Produktion bzw. den
Nachweis flüchtiger und nichtflüchtiger Säuren in anaerober Bakterienkultur 90
4.4 Nachweis flüchtiger und nicht flüchtiger Säuren in Kulturmedien von Anaerobiern
(Referenz und Wildstämme) mittels HPLC Methode 93
4.4.1 Gramnegative anaerobe Stäbchenbakterien 95
4.4.1.1 Genus Bacteroides 95
4.4.1.2 Genus Prevotella 97
4.4.1.3 Genus Porphyromonas und andere neugenannte frühere Bacteroides Arten
(Megamonas, Mitsuokella, Rikenella, Tissierellä) 99
4.4.1.4 Genus Fusobacteriwn 101
4.4.2 Grampositive anaerobe sporenlose Stäbchenbakterien 102
4.4.2.1 Genus Bifidobacterium 102
4.4.2.2 Genus Eubacterium 104
4.4.2.3 Genus Lactobaäüus 104
4.4.2.4 Genus Propionibacterium 104
4.4.3 Grampositive sporenbildende anaerobe Bakterien (Genus Clostridium) 106
4.4.3.1 Genus Clostridium 106
4.4.4 Obligat anaerobe grampositive und negative Kokken 113
4.4.4.1 Genus Peptostreptococcus I Staphylococcus saccharolyticus
(grampositive anaerobe Kokken) 113
4.4.4.2 Genus Veillonella (gramnegative anaerobe Kokken) 117
5. DISKUSSION 119
5.1 Biochemische Identifizierung der Anaerobier 119
5.1.1 Identifizierung der anaeroben Bakterien mit dem ATB 32A System
(BioMerieux) 119
5.2 HPLC Analyse flüchtiger und nichtflüchtiger Säuren 121
5.2.1 Einfluß verschiedener Faktoren auf die Analyse kurzkettiger Säuren
(Extraktionsverfahren, Temperaturen, Fließmittel) mittels HPLC Methode 124
5.2.2 Einfluß verschiedener Faktoren auf die Produktion von Säuren bei
Anaerobiern (Nährmedium, Bebrütungszeit) 127
5.3 Identifizierung bzw. Differenzierung der anaeroben Bakterien durch Analyse
flüchtiger und nichtflüchtiger Säuren als Stoffwechselprodukte in Kultur¬
medien mittels HPLC Methode 129
5.3.1 Gramnegative Anaerobier (Bacteroides, Prevotella, Pophyromonas,
Megamonas, Mitsuokella, Rikenella, Tissierella, Fusobacterium) 131
5.3.1.1 Bacteroides 132
5.3.1.2 Prevotella 135
5.3.1.3 Porhyromonas 136
5.3.1.4 Megamonas, Mitsuokella, Rikenella, Tissierella 138
5.3.1.5 Fusobacterium 139
5.3.2 Grampositive sporenlose Anaerobier (Bifodobacterium, Eubacterium,
Lactobacillus, Propionibacterium) 142
5.3.3 Grampositive sporenbildende Anaerobier 145
5.3.3.1 Genus Clostridium 145
5.3.4 Anaerobe grampositive und negative Kokken 150
5.3.4.1 Peptostreptococcus I Staphylococcus saccharolyticus (grampositive Kokken) 151
5.3.4.2 Genus Veillonella (gramnegative Kokken) 154
5.4 Schlußfolgerung und Ausblick 155
6. ZUSAMMENFASSUNG 157
7. LITERATURVERZEICHNIS I
8. ANHANG
8.1 Tabellen 1
8.2 Chromatogramme 52
8.3 Verwendete Files für die quantitative und qualitative Analyse kurzkettiger Säuren 117
8.4 Statistischer Vergleich 119
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