Mechanismen der Aktivierung von NF-Kappa-B: einem Regulator von Apoptose und Zellproliferation
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1997
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INNALTSVERZECNMS
L
INHALTSVERZEICHNIS
1
ZUSAMMENFASSUNG
--------------------------------------------------------------------------
4
2
EINLEITUNG
.
6
2.1
VIELE
FUNKTIONEN
EUKARYOTISCHER
ZELLEN
WERDEN
AUF
DER
EBENE
DER
TRANSKRIPTION
REGULIERT
.
6
2.2
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
SIND
ZIELE
DER
SIGNALTRANSDUKTION
.
7
2.3
DIE
NF-KB/LKB-PROTEINE
SIND
MEDIATOREN
EXTRAZELLULAERER
SIGNALE
.
9
2.3.1
DIE
STRUKTUR
DER
NF
K
B
UND
IICB-PROTEINE
.
10
2.3.2
STUDIEN
AN
NF
K
B
UND
HCB-DEFIZIENTEN
MAEUSEN
ZEIGEN
EINE
VORWIEGEN
DE
ROLLE
VON
NF
K
B
IM
IMMUNSYSTEM
.
13
2.3.3
AKTIVIERUNG
VON
NF
K
B
WIRD
DURCH
KOMPLEXE
MECHANISMEN
REGULIERT
.
14
2.3.4
EINE
AUTOREGULATORISCHE
SCHLEIFE
KONTROLLIERT
DIE
TRANSIENTE
AKTIVIERUNG
VON
NF
K
B
.
20
2.4
NF
K
B
AKTIVIERUNG
UND
INDUKTION
VON
ZELLTOD
DURCH
DIE
REZEPTOREN
DER
TNF-FAMILIE
.
22
2.5
DEREGULATION
DER
NF-KB/LKB-PROTEINE
IN
ZELLULAERER
TRANSFORMATION
UND
KRANKHEIT
.
25
2.6
DARSTELLUNG
DES
PROJEKTS
.
27
3
ERGEBNISSE
.
.29
3.1
NF
K
B
AKTIVITAET
WIRD
DURCH
DIE
STABILITAET
DER
INHIBITOREN
REGULIERT
.
29
3.1.1
TNFA-INDUZIERTE
PHOSPHORYLIERUNG
UND
DEGRADATION
DER
I
K
B
S
FUEHRT
ZUR
AKTIVIERUNG
VON
NF
K
B
.
29
3.1.2
I
K
B
OI
UND
M3SS
ZEIGEN
EINEN
ERHOEHTEN
TUMOVER
IN
REIFEN
B-ZELLEN
.
32
3.1.3
ANALYSE
DER
SIGNAL-INDUZIERTEN
DEGRADATION
UND
DES
BASALEN
PROTEINTUR
NOVER
VON
I
K
B
CC
IN
INTAKTEN
ZELLEN
.
34
3.1.3.1
IKBA-UBIQUITINYLIERUNG
IN
HELA-ZELLEN
IST
SIGNAL-ABHAENGIG;
VERGLEICH
MIT
C-JUN
.
35
3.1.3.2
NF-KB-INTERAKTION
UND
HCBA-STABILITAET
WERDEN
DURCH
DIE
ANKYRIN
REPEATS
VERMITTELT
.
40
3.1.3.3
UBIQUITINYLIERUNG
VON
I
K
B
CC
IST
NICHT
NOTWENDIG
FUER
DEN
BASALEN
TUMOVER
.
46
3.1.3.4
IKBA-TUMOVER
IST
ABHAENGIG
VOM
PROTEASOM
.
47
3.1.4
PERSISTENTE
AKTIVIERUNG
VON
NF
K
B
IN
HELA-ZELLEN
BENOETIGT
DIE
KONTINU
IERLICHE
ANWESENHEIT
DES
STIMULUS
.
49
3.2
NF
K
B:
EIN
REGULATOR
VON
APOPTOSE
UND
ZELLPROLIFERATION
.
52
3.2.1
TNFA/CYCLOHEXIMID
INDUZIEREN
APOPTOSE
IN
HELA-ZELLEN
.
52
3.2.2
BLOCKIERUNG
DER
INDUZIERBAREN
AKTIVIERUNG
VON
NF
K
B
IN
HELA-ZELLEN
VERSTAERKT
DIE
APOPTOTISCHE
WIRKUNG
VON
TNFA
.
54
3.2.3
DIE
APOPTOSE-HEMMENDE
WIRKUNG
VON
NF
K
B
IST
ABHAENGIG
VOM
ZELLTYP
UND
DER
ART
DES
APOPTOTISCHEN
SIGNALS
.
57
3.2.4
DIE
ENTSTEHUNG
EINER
TRUNKIERTEN
FORM
VON
HCBA
KORRELIERT
MIT
TNFA
UND
FAS-ANTIKOERPER-INDUZIERTER
APOPTOSE
IN
MCF7-ZELLEN
.
60
INHAL
TSVERZECHNIS
_
J.
3.2.5
BLOCKIERUNG
DER
KONSTITUTIVEN
NF-KB-AKTIVITAET
SENSIBILISIERT
HDMYZ
ZELLEN
GEGENUEBER
STRESS-INDUZIERTER
APOPTOSE
.
65
3.2.6
NF
K
B
IST
EIN
POSITIVER
REGULATOR
DER
ZELLPROLIFERATION
IN
HDMYZ
ZELLEN
.
68
4
DISKUSSION
.
70
4.1
IKB-PROTEINE
KONTROLLIEREN
DIE
AKTIVITAET
VON
NF
K
B
.
70
4.1.1
UNTERSCHIEDLICHE
MECHANISMEN
SIND
VERANTWORTLICH
FUER
DIE
SIGNAL
ABHAENGIGE
DEGRADATION
UND
DEN
BASALEN
PROTEINTUMOVER
VON
I
K
B
X
.
72
4.1.2
DIE
BEDEUTUNG
DES
TUMOVER
FUER
DIE
STIMULIERTE
UND
DIE
KONSTITUTIVE
AK
TIVIERUNG
VON
NF
K
B
.
75
4.1.3
I
K
B
S
GARANTIEREN
EINE
TRANSIENTE
AKTIVIERUNG
VON
NF
K
B
.
77
4.1.4
DIE
FUNKTIONEN
VON
I
K
B
OC
KOENNEN
UNTERSCHIEDLICHEN
PROTEINDOMAENEN
ZUGEORDNET
WERDEN
.
78
4.2
NF
K
B/I
K
B
PROTEINE
REGULIEREN
APOPTOSE
UND
ZELLPROLIFERATION
.
81
4.2.1
DIE
VERBINDUNG
ZWISCHEN
NF
K
B
UND
APOPTOSE
.
81
4.2.2
DIE
VERBINDUNG
ZWISCHEN
NF
K
B
UND
ZELLPROLIFERATION
.
86
5
MATERIAL
.
89
5.1
GERAETE
.
89
5.2
CHEMIKALIEN
.
90
5.3
ENZYME
UND
KITS
.
91
5.4
BAKTERIENKULTURMEDIEN
.
91
5.5
ZELLKULTURMEDIEN
UND
ZELLINIEN
.
92
5.6
ANTIKOERPER
.
92
5.7
PLASMIDE
.
93
5.8
OLIGONUKLEOTIDE
.
95
5.9
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
95
6
METHODEN
.
96
6.1
ZELLKULTUR
.
96
6.1.1
KULTUR
ADHAERENTER
ZELLEN
.
96
6.1.2
SUSPENSIONSZELLKULTUR
.
96
6.1.3
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
.
96
6.1.4
BEHANDLUNG
DER
ZELLEN
MIT
INHIBITOREN
UND
STIMULATOREN
.
97
6.1.5
TRANSFEKTION
VON
PLASMID-DNA
IN
EUKARYOTISCHE
ZELLEN
.
97
6.1.5.1
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
.
97
6.1.5.2
STABILE
TRANSFEKTION
.
98
6.1.6
BESTIMMUNG
DER
APOPTOSE
MIT
HILFE
DER
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
.
98
6.1.7
BESTIMMUNG
DER
ZELLPROLIFERATION
.
99
6.2
DNA-ARBEITEN
.
99
6.2.1
MINI-PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
.
99
6.2.2
MAXI-PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
.
100
6.2.3
PCR-VERMITTELTE
MUTAGENESE
.
100
6.2.4
EINFUEHRUNG
VON
PUNKTMUTATIONEN
.
101
6.2.5
RESTRIKTION
VON
DNA
.
102
6.2.6
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
102
INHAL
TSVERZECHNIS
1
6.2.7
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
102
6.2.8
LIGATION
VON
DNA
.
102
6.2.9
HYBRIDISIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
103
6.2.10
[
32
P]-ENDMARKIERUNG
DOPPELSTRAENGIGER
DNA-OLIGONUKLEOTIDE
.
103
6.2.11
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
.
103
6.2.12
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
.
104
6.2.13
DNA-SEQUENZIERUNG
UND
POLYACRYLAMID-SEQUENZGELE
.
104
6.3
HERSTELLUNG
VON
ZELLEXTRAKTEN
UND
PROTEIN-ARBEITEN
.
105
6.3.1
PRAEPARATION
VON
GESAMTZELLEXTRAKTEN
.
105
6.3.2
KOIMMUNOPRAEZIPITATION
ZUM
NACHWEIS
VON
PROTEININTERAKTIONEN
.
105
6.3.3
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
I
K
B
OC
MIT
PHOSPHATASE
.
106
6.3.4
NACHWEIS
VON
UBIQUITIN-KONJUGATEN
.
106
6.3.4.1
HAMSTOFFLYSE
VON
TRANSFIZIERTEN
HELA-ZELLEN
.
107
6.3.4.2
REINIGUNG
VON
HISTIDIN-MARKIERTEN
PROTEINEN
UEBER
NI
2+
-NTA
AGAROSE
.
107
6.3.4.3
PROTEINFAELLUNG
MIT
TRICHLORESSIGSAEURE
(TCA)
.
108
6.3.5
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
108
6.3.6
WESTERN-BLOT
.
109
6.3.7
GELRETARDIERUNGS-EXPERIMENT
(EMSA
"ELEKTROPHORETIC
MOBILITY
SHIFT
ASSAY
"
)
.
109
6.3.8
PULSE-CHASE
EXPERIMENT
.
110
6.3.8.1
METABOLISCHE
MARKIERUNG
DER
ZELLEN
UND
HERSTELLUNG
DER
EXTRAKTE
.
111
6.3.8.2
IMMUNOPRAEZIPITATION
[
35
S]-METHIONIN
MARKIERTER
PROTEINE
.
112
6.3.8.3
QUANTIFIZIERUNG
VON
PULSE-CHASE
EXPERIMENTEN
.
113
6.3.9
IMMUNOFLUORESZENZ
.
113
7
ABKUERZUNGEN
.
114
8
LITERATUR
_
116
9
ANHANG
.
130
9.1
PUBLIKATIONEN
.
130
9.2
DANKSAGUNG
.
131
9.3
LEBENSLAUF.
.
132 |
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