Charakterisierung der Tetrahydrofuran-Monooxygenase aus Rhodococcus ruber 219:
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
PROBLEMSTELLUNG
.
9
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
10
2.1
CHEMIKALIEN
UND
REAGENZIEN
.
10
2.2
MEDIEN
UND
NAEHRBOEDEN
.
11
2.3
BAKTERIENSTAEMME
UND
STAMMHALTUNG
.
13
2.4
ZELLANZUCHT
.
13
2.4.1
ZELLANZUCHT
FUER
DIE
PROTEINREINIGUNG
.
13
2.4.2
ZELLANZUCHT
FUER
DIE
ISOLIERUNG
VON
DNA
.
14
2.4.2.1
DNA
AUS
R.
RUBER
219
.
14
2.4.2.2
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
K12
.
14
2.5
OPTISCHER
TEST
ZUM
NACHWEIS
DER
TETRAHYDROFIIRAN-MONOOXYGENASE
.
15
2.6
PROTEINREINIGUNG
.
16
2.6.1
ZELLAUFSCHLUSS
UND
PRAEPARATION
DES
ROHEXTRAKTES
.
17
2.6.2
FRAKTIONIERTE
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
.
17
2.6.3
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
.
18
2.6.3.1
GELFILTRATION
.
18
2.6.3.2
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
19
2.6.3.3
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
.
20
2.6.4
DIAFILTRATION
.
20
2.7
PROTEINBESTIMMUNG
.
21
2.8
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
21
2.9
WESTEM-BLOTTING
.
23
2.10
N-TERMINALE
SEQUENZBESTIMMUNGEN
.
24
2.11
PHOTOMETRISCHER
TEST
ZUM
NACHWEIS
DER
TMO-REDUKTASE-AKTIVITAET
.
24
2.12
AKTIVITAETSFAERBUNG
DER
TMO-REDUKTASE
.
25
2.13
DNA-PRAEPARATIONEN
.
26
2.13.1
CHROMOSOMALE
DNA
VON/?,
RUBER
219
.
26
2.13.2
PLASMID-DNA
VON
R.
RUBER
219
.
26
2.13.3
PLASMID-DNA
VON
E.
COLI
.
28
2.14
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
28
2.15
PCR
.
29
2.16
DNA-SPALTUNG
MIT
RESTRIKTIONSENDONUCLEASEN
.
30
2.17
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
30
2.18
LIGATION
VON
PCR-FRAGMENTEN
IN
PUC18
.
31
2.19
TRANSFORMATION
.
31
2.20
DIGOXIGENIN-MARKIERUNG
VON
OLIGONUCLEOTIDEN
.
32
2.21
HYBRIDISIERUNG
VON
OLIGONUCLEOTID-SONDEN
AN
CHROMOSOMALE
DNA
VON
R.
RUBER
.
32
2.22
VERWENDETE
DATENERFASSUNGS
UND
DATENVERARBEITUNGSSYSTEME
.
34
3
ERGEBNISSE
.
35
3.1
ANREICHERUNG
DER
THF-HYDROXYLASE-AKTIVITAET
.
35
3.1.1
FRAKTIONIERTE
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
.
35
3.1.2
GELFILTRATION
.
35
3.1.3
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
37
3.1.4
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
.
38
3.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
THF-HYDROXYLASE-AKTIVITAET
.
39
3.2.1
TEST
ZUM
NACHWEIS
DER
THF-HYDROXYLASE-AKTIVITAET
.
40
3.2.1.1
MIT
THF
UND
2,5-DIMETHYL-THF
ALS
SUBSTRAT
.
40
3.2.2
VARIATION
DES
TESTES
.
41
3.2.2.1
REAKTIONSVERLAUF
.
41
3.2.2.2
ABHAENGIGKEIT
DER
AKTIVITAET
VON
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
43
3.2.2.3
SUBSTRATKONZENTRATION
.
44
3.2.2.4
UNSPEZIFISCHER
EINFLUSS
DES
SUBSTRATES
.
46
3.2.3
REKONSTITUTION DER
THF-HYDROXYLASE-AKTIVITAET
.
46
3.2.3.1
KOMPLEMENTATIONSTESTS
.
47
3.3
NACHWEIS
EINES
MEHRKOMPONENTEN-SYSTEMES
.
47
3.3.1
BEZEICHNUNG
DER
TMO-KOMPONENTEN
.
51
3.3.1.1
KOMPONENTE
A
(REDUKTASE)
.
51
3.3.1.2
KOMPONENTE
B
(HYDROXYLASE)
.
53
3.3.1.3
KOMPONENTE
C
.
54
3.3.2
TRANSFORMIERBARE
SUBSTRATE
.
58
3.4
DARSTELLUNG
DER
TMO-REDUKTASE
.
59
3.4.1
REDUKTASETEST
.
59
3.4.2
REINIGUNG
DER
REDUKTASE
.
60
3.4.3
DARSTELLUNG
DURCH
SDS-PAGE
.
65
3.4.4
AKTIVITAETSFAERBUNG
.
67
3.4.5
WESTEM-BLOTTING
DER
TMO-REDUKTASE
.
68
3.4.6
N-TERMINALE
SEQUENZIERUNG
DER
TMO-REDUKTASE
.
69
3.4.6.1
SEQUENZVERGLEICH
UND
HOMOLOGIEN
.
69
3.5
REINIGUNG
DER
KOMPONENTE
C DER
TMO
.
70
3.5.1
WESTEM-BLOTTING
DER
KOMPONENTE
C
.
71
3.5.2
N-TERMINALE
SEQUENZIERUNG
DER
KOMPONENTE
C
.
71
3.5.2.1
SEQUENZVERGLEICHE
UND
HOMOLOGIEN
.
72
3.6
PARTIELLE
REINIGUNG
DER
TMO-HYDROXYLASE
(KOMPONENTE
B)
.
73
3.7
MOLEKULARBIOLOGISCHE
APPROACHES
AN
DIE
TMO-GENE
.
76
3.7.1
DESIGN
VON
OLIGONUCLEOTIDEN
ZUR
SUCHE
NACH
DEN
TMO-GENEN
.
76
3.7.2
PCR
MIT
DEN
TMO-OLIGONUCLEOTIDEN
AN
CHROMOSOMALER
UND
PLASMID-DNA
.
78
3.7.3
HYBRIDISIERUNG
CHROMOSOMALER
DNA
MIT
TMO-OLIGONUCLEOTIDEN
.
82
4
DISKUSSION
.
85
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
112
6
LITERATUR.
114
7
ANHANG
.
126 |
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