Untersuchungen zur Proteinfaltung durch Protein-Design am Retinol-Bindungsprotein:
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| Format: | Book |
| Language: | German |
| Published: |
München
Utz, Wiss.
1998
|
| Series: | Chemie
|
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| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Item Description: | Zugl.: Darmstadt, Techn. Univ., Diss., 1998 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
DAS
RETINOL-BINDUNGSPROTEIN
(RBP):
STRUKTUR
UND
FUNKTION
.
1
1.2
DIE
LIPOCALIN-PROTEINFAMILIE:
SEQUENZ
UND
STRUKTURHOMOLOGIE
ALS
BASIS
FUER
RATIONALES
DESIGN
.
3
1.3
DIE
METALLBINDENDE
VARIANTE
RBP/H
3
(A)
ALS
AUSGANGSPUNKT
FUER
WEI
TERES
PROTEIN
DESIGN
-
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
5
2
MATERIAL
UND
METHODEN
9
2.1
MATERIAL
.
9
2.1.1
BAKTERIENSTAEMME
UND
BAKTERIOPHAGEN
.
9
2.1.2
PLASMIDE
.
10
2.1.3
OLIGODESOXYNUKLEOTIDE
.
10
2.1.4
PROTEINE
.
12
2.1.5
CHEMIKALIEN
.
13
2.1.6
STANDARDS
UND
KITS
.
16
2.1.7
GERAETE
.
17
2.1.8
SONSTIGES
MATERIAL
.
19
2.1.9
PUFFER
UND
MEDIEN
.
20
2.2
MIKROBIOLOGISCHE
UND
GENTECHNISCHE
METHODEN
.
22
2.2.1
ANZUCHT
UND
LAGERUNG
VON
E.
CO/Z-STAEMMEN
.
22
2.2.2
ISOLIERUNG
VON
DNA
.
23
2.2.2.1
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
.
23
22.2.2
PRAEPARATION
VON
EINZELSTRANG-DNA
.
23
2.2.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
.
25
2.2.4
ENZYMATISCHE
SPALTUNG
UND
MODIFIZIERUNG
VON
DNA
.
25
2.2.4.1
SPALTUNG
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
.
25
2.2.4.2
LIGIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
26
2.2.5
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
26
2.2.6
POLYACRYLAMID-HAMSTOFF-GELELEKTROPHORESE
.
27
2.2.6.1
REINIGUNG
VON
OLIGODESOXYNUKLEOTIDEN
.
27
2.2.62
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.
28
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.7
ORTSGERICHTETE
MUTAGENESE
.
30
2.2.8
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
31
2.3
GENTECHNISCHE
PRODUKTION
VON
RBP
UND
SEINEN
VARIANTEN
.
32
2.3.1
PRAEPARATIVE
KULTIVIERUNG
VON
E.
COLI
.
32
2.3.2
PERIPLASMAAUFSCHLUSS
.
33
2.3.3
GESAMTZELLAUFSCHLUSS
.
34
2.3.4
OPTIMIERUNG
DER
LYSOZYMKONZENTRATION
IN
EINEM
PERIPLASMAAUFSCHLUSS
.
34
2.3.5
ANALYTISCHE
ZELLFRAKTIONIERUNG
UND
TRYPSINVERDAU
.
35
2.4
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
36
2.4.1
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.
36
2.4.2
WESTERN-BLOT
.
37
2.4.3
CHROMATOGRAPHISCHE
METHODEN
.
38
2.4.3.1
STREPTAVIDIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
39
2.4.3.2
METALLCHELAT-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE.
40
2.4.4
KONZENTRIERUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
.
41
2.4.5
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
GEREINIGTEN
PROTEINEN
.
42
2.4.6
ENZYMKINETIK
.
43
2.4.6.1
SS-LACTAMASE
.
43
2.4.6.2
GLYCERINALDEHYDPHOSPHAT-DEHYDROGENASE
.
44
2.5
BIOPHYSIKALISCHE
ANALYSEN
.
45
2.5.1
FLUORESZENZTITRATION
.
45
2.5.1.1
TITRATION
MIT
RETINSAEURE
UND
RETINOL
.
46
2.5.1.2
TITRATION
MIT
ANS
.
47
2.5.1.3
TITRATION
MIT
BISANS
.
48
2.5.2
KINETISCHE
MESSUNG
DER
RETINOLBINDUNG
.
49
2.5.3
DENATURIERUNG
MIT
GUANIDINIUMCHLORID
.
51
2.5.3.1
EXPERIMENTELLE
DURCHFUEHRUNG
.
51
2.5.3.2
MATHEMATISCHE
AUSWERTUNG
DER
DENATURIERUNGSKURVE
.
53
2.5.3.3
BESTIMMUNG
VON
AG-DIFFERENZEN
.
54
2.5.4
KINETISCHE
ANALYSE
DER
PROTEINFALTUNG
.
54
2.5.4.1
MATHEMATISCHE
AUSWERTUNG
.
55
2.5.4.2
MANUELLE
MISCHMETHODE
.
58
2.5.4.3
STOPPED
FLOW-MESSUNGEN
.
59
2.5.5
MESSUNG
VON
METALLBINDUNGSISOTHERMEN
AN
EINER
CHROMATOGRAPHIE
MATRIX
.
59
2.5.6
CD-SPEKTROSKOPIE
.
61
INHALTSVERZEICHNIS
III
2.6
KRISTALLISATIONSVERSUCHE
MIT
RBP
.
62
2.7
ORGANISCH-CHEMISCHE
METHODEN
.
63
2.7.1
SYNTHESE
VON
7V
"
-CARBOXYMETHYL-(L)-LYSIN
.
63
2.7.2
SYNTHESE
VON
FORMYL-METHYL-PYRROLIDINDICARBONSAEURE
(FINPDC)
.
64
2.7.3
SYNTHESE
DER
SAEULENMATERIALIEN
.
65
2.7.3.1
AKTIVIERUNG
DER
SEPHAROSE
.
65
2.7.3.2
KOPPLUNG
AN
AKTIVIERTE
SEPHAROSE
.
66
2.7.3.3
SYNTHESE
DER
PDC-CHROMATOGRAPHIEMATRIX
.
66
2.8
VERWENDETE
COMPUTERPROGRAMME
.
67
2.8.1
MOLECULAR
MODELLING
.
67
2.8.2
SEQUENZANALYSEN
.
67
2.8.3
AUSWERTUNG
VON
MESSDATEN
.
67
3
ERGEBNISSE
69
3.1
DESIGN
EINES
NEUEN
CHELATLIGANDEN
ZUR
REINIGUNG
DES
RBP
MIT
EINER
METALLBINDUNGSSTELLE
.
69
3.1.1
SYNTHESE
UND
IMMOBILISIERUNG
DER
LIGANDEN
.
69
3.1.1.1
SYNTHESE
VON
N
"
-CARBOXYMETHYL-(L)-LYSIN
.
69
3.1.1.2
SYNTHESE
VON
PYRROLIDINDICARBONSAEURE
(PDC)
.
72
3.1.1.3
METALLBINDUNGSEIGENSCHAFTEN
VON
PDC
UND
IDA-SEPHAROSE
.
75
3.1.2
CHROMATOGRAPHISCHE
EIGENSCHAFTEN:
REINIGUNG
DES
RBP
MIT
EINER
ME
TALLBINDUNGSSTELLE
BZW.
MIT
EINEM
HISTIDIN-ANHAENGSEL
.
77
3.2
KONSTRUKTION
VON
RBP-VARIANTEN
MIT
VERBESSERTER
FALTUNGSSTABILITAET
.
80
3.2.1
GRUNDLAGEN
UND
STRATEGIE
FUER
DIE
MODELLIERUNG
.
80
3.2.2
KONSTRUKTION
DER
MODELLE
RBP/ML,
RBP/M2,
RBP/M3,
RBP/M5
UND
RBP/M7
.
81
3.2.3
GENTECHNISCHE
HERSTELLUNG
DER
RBP-VARIANTEN
IN
E.
COLI
.
86
3.2.4
ERMITTLUNG
DER
FALTUNGSSTABILITAET
DURCH
REVERSIBLE
DENATURIERUNG
.
88
3.2.5
UNTERSUCHUNG
DER
RETINOL-BINDUNGSAKTIVITAET
.
90
3.2.6
VERGLEICH
DER
RETINOLBINDUNGSKINETIK
VON
RBP/ML
UND
RBP/H3(A)
.
92
3.3
DELETION
DER
DREI
DISULFIDBRUECKEN
IM
RBP
.
93
3.3.1
STABILITAET
DER
RBP-VARIANTEN
IN
GEGENWART
EINES
REDUKTIONSMITTELS
.
93
3.3.2
KONSTRUKTION
DER
VARIANTEN
RBP/M5AA,
RBP/M5AAB
UND
RBP/M5AABC.
94
3.3.3
GENTECHNISCHE
PRODUKTION
IN
E.
COLI
.
97
3.3.4
BESTIMMUNG
DER
FALTUNGSSTABILITAET
DURCH
REVERSIBLE
DENATURIERUNG
.
100
3.4
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
DER
RBP-VARIANTEN
.
101
3.4.1
STABILISIERUNG
DURCH
DIE
METALLBINDUNGSSTELLE
IN
GEGENWART
VON
ZINK
.
102
3.4.2
INDIREKTE
CHARAKTERISIERUNG
DER
SS-BARREL-STRUKTUR
DURCH
DAS
RETENTIONS
VERHALTEN
AN
PDC-SEPHAROSE
.
103
3.4.3
TITRATION
MIT
ANS
ZUR
BESTIMMUNG
DER
HYDROPHOBEN
OBERFLAECHE
.
105
3.4.4
TITRATION
MIT
BISANS
ZUR
ANALYSE
DER
HYDROPHOBEN
OBERFLAECHE
.
107
3.4.5
CD-SPEKTROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNGEN
.
109
3.4.6
KRISTALLISATIONSVERSUCHE
.
111
3.5
KINETISCHE
ANALYSE
DER
RBP-FAITUNG
.
112
3.6
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FALTUNG
DES
RBP
IN
E.
COLI
.
117
3.6.1
EINFLUSS
DES
DRTC-PROTEINS
AUF
DIE
AUSBILDUNG
DER
DISULFIDBINDUNGEN
.
117
3.6.2
EINFLUSS
DER
FALTUNGSEIGENSCHAFTEN
AUF
DIE
PERIPLASMATISCHE
SEKRETION
VON
RBP/H
3
(A),
RBP/M5
UND
RBP/M5AABC
.
119
4
DISKUSSION
125
4.1
DIE
METALLCHELAT-AFFLNITAETSCHROMATOGRAPHIE
ALS
INDIKATOR
FUER
DIE
PROTEINFALTUNG.
125
4.2
DIE
AUSWIRKUNGEN
GEZIELTER
MANIPULATIONEN
AM
HYDROPHOBEN
CORE
UND
AN
DEN
DISULFIDBRUECKEN
IM
RBP
.
129
4.2.1
DER
EINFLUSS
HYDROPHOBER
WECHSELWIRKUNGEN
AUF
DIE
STABILITAET
UND
FAL
TUNG
DES
RBP
.
129
4.2.2
DER
BEITRAG
VON
DISULFIDBRUECKEN
ZUR
STABILITAET
DES
RBP
.
134
4.2.3
DIE
AENDERUNG
DER
FALTUNGSKINETIK
DURCH
VARIATIONEN
AM
HYDROPHOBEN
CORE
UND
ELIMINIERUNG
DER
DISULFIDBRUECKEN
.
138
4.3
DER
EINFLUSS
DER
FALTUNGSEIGENSCHAFTEN
AUF
DIE
PERIPLASMATISCHE
SEKRETION
.
140
4.4
DER
EINFLUSS
DES
DSFIC-PROTEINS
AUF
DIE
FALTUNG
DES
RBP
IM
PERIPLAS
MA
.
142
5
LITERATUR
145
6
ZUSAMMENFASSUNG
161
INHALTSVERZEICHNIS
V
7
ABKUERZUNGEN
UND
SYMBOLE
163
8
ANHANG
165
8.1
DIE
KODIERENDE
SEQUENZ
FUER
RBP/HJ(A)
MIT
DEN
GENTECHNISCHEN
VERAENDERUNGEN
.
165
8.2
ZUSAMMENSTELLUNG
DER
KONSTRUIERTEN
RBP-VARIANTEN
.
168 |
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