Mutanten der Katabolitrepression in Bacillus megaterium:
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1998
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
.
I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
IV
1.
ZUSAMMENFASSUNG
.
1
2.
EINLEITUNG
.
2
2.1
REGULATION
DER
GENEXPRESSION
ALS
ADAPTIONSMECHANISMUS
.
2
2.1.1
TRANSKRIPTIONSKONTROLLE
DURCH
REGULATORPROTEINE
.
2
2.1.2
UEBERGEORDNETE
UND
GLOBALE
KONTROLLE
AM
BEISPIEL
DES
XY/-OPERONS
VON
BACILLUS
MEGATERIUM
.
2
2.2
KATABOLITREPRESSION
.
3
2.2.1
KATABOLITREPRESSION
IN
ENTEROBAKTERIEN
.
4
2.2.2
KATABOLITREPRESSION
IN
GRAM
POSITIVEN
BAKTERIEN
.
5
2.2.3
KOMPONENTEN
DER
KATABOLITREPRESSION
IN
BACILLI.
6
2.2.3.1
DAS
YYCATABOLITE
CONTROL
PROTEIN
"
CCPA
.
6
2.2.3.2
DAS
YYCATABOLITE
RESPONSIVE
ELEMENT
"
CRE
.
7
2.2.3.3
DAS
HITZESTABILE
PROTEIN
HPR
.
8
2.2.4
ZUSAMMENSPIEL
DER
KOMPONENTEN
IN
DER
KATABOLITREPRESSION
DES
XYAOPERONS
VON
BACILLUS
MEGATERIUM
.
10
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
12
3.1
MATERIALIEN
.
12
3.2
VERWENDETE
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE
.
14
3.3
PUFFER
UND
MEDIEN
.
16
3.3.1
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
16
3.3.2
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
GELELEKTROPHORESE
.
16
3.3.3
GROESSENSTANDARDS
FUER
DIE
GELELEKTROPHORESE
.
16
3.3.4
BAKTERIENNAEHRMEDIEN
.
17
3
4
METHODEN
.
18
INHALTSVERZEICHNIS
II
3.4.1
ALLGEMEINE
METHODEN
.
18
3.4.2
TRANSFORMATION
VON
BACILLUS
MEGATERIUM
.
18
3.4.3
PRAEPARATION
VON
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
BACILLUS
MEGATERIUM
.
19
3.4.4
SOUTHERN-BLOT
.
20
3.4.5 MUTAGENSE
VON
BACILLUS
MEGATERIUM
DURCH
EMS
.
21
3.4.6
PRAEPARATION
DES
GESAMTPROTEINS
AUS
BACILLUS
MEGATERIUM
.
21
3.4.7
ENZYMAKTIVITAETSBESTIMMUNGEN
.
22
3.4.7.1
SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAETSBESTIMMUNG.
22
3.4.7.2
AKTIVITAETSBESTIMMUNG
DER
GLUKOSEKINASE
.
22
3.4.7.3
HPR-KINASE-ASSAY
.
23
3.4.7.4 BESTIMMUNG
DER
CHLORAMPHENICOL-ACETYLTRANSFERASE-AKTIVITAET
.
23
3.4.7.5
GLUKOSEKINASE-ASSAY
.
24
3.4.8
METHODEN
ZUR
MODIFIKATION
VON
DNA
.
24
3.4.8.1
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
24
3.4.8.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
25
3.4.8.3
PRAEPARATION
VON
5
'
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
DNA
FRAGMENTEN
.
25
3.4.9
DNASEL-SCHUTZEXPERIMENTE
.
26
4
ERGEBNISSE
.
27
4.1
IN
VITRO
STUDIEN
ZUR
BINDUNG
VON
CCPA
AN
CRE
.
27
4.1.1
SPEZIFITAET
DER
BINDUNG
IM
DNASEL-FOOTPRINT
.
27
4.1.2
METHYLIERUNGSSCHUTZ
.
28
4
1.3
EINFLUSS
VON
NADP*
AUF
DIE
BINDUNG
VON
CCPA
AN
CRE
.
30
4.2
KONSTRUKTION
EINES
STAMMES
MIT
CCPA-DELETION
(WH356)
.
31
4.3
UNGERICHTETE
MUTATIONEN
IM
CCPA-GEN
UND
IHRE
AUSWIRKUNGEN
.
34
4.3.1
EMS-MUTAGENESE
VON
WH331
UND
ISOLATION
VON
CCPA-MUTANTEN
.
34
4.3.2
KONSTRUKTION
VON
WH398
UND
ISOLATION
VON
SPONTANEN
CCPA-MUTANTEN.
34
4.3.3
SEQUENZANALYSE
DER
MUTATIONEN
.
37
4.3.4 QUANTIFIZIERUNG
DER
GLUKOSEREPRESSION
IN
DEN
CCPA-MUTANTEN
.
38
4.3.5 WACHSTUM
DER
CCPA-MUTANTEN
.
39
4.3.6
WESTERN-BLOT-ANALYSEN
.
39
4.3.7
TEST
AUF
TRANSDOMINANZ
.
41
INHALTSVERZEICHNIS
III
4.4
GERICHTETE
MUTATIONEN
IN
CCPA
.
44
4.4.1
KLONIERUNG
DER
MUTANTEN
.
44
4.4.2
GLUKOSEREPRESSION,
TRANSDOMINANZ
UND
WACHSTUM
.
46
4.4.3
WECHSELWIRKUNG
DER
CCPA-MUTANTEN
AN
POSITION
295,299
UND
303
MIT
CRE
IN
VITRO
.
48
4.4.3.1
UMKLONIERUNG
DER
MUTANTEN
IN
UEBEREXPRESSIONSVEKTOREN
.
48
4.4.3.2
DNASEL-SCHUTZEXPERIMENTE
.
50
4.5
ISOLATION
VON
WEITEREN
GR'-MUTANTEN
.
51
4.5.1
GLUKOSEREPRESSION
DER
XY/A-/ACZ-FUSION
UND
ISOLATION
VON
PWH2060.
51
4.5.2
GLUKOSEREPRESSION
DER
XY/A-CAF-FUSION
.
53
4.5.3
TEST
AUF
PLEIOTROPIE
DES
EFFEKTS
.
54
4.5.4
TEST
AUF
GLUKOSEKINASE
UND
HPR-KINASE-AKTIVITAET
.
55
4.5.5
WACHSTUM
AUF
GLUKOSE
.
57
4.5.6
KOMPLEMENTATIONSVERSUCHE
.
57
4.5.7
CHARAKTERISIERUNG
DES
PLASMIDS
PGRX4
.
58
5
DISKUSSION
.
62
5.1
MUTANTEN
DES
YYCATABOLITE
CONTROL
PROTEIN
"
CCPA
.
62
5.1.1
CCPA
GEHOERT
IN
DIE
LACL/GALR-FAMILIE
BAKTERIELLER
REPRESSOREN
.
62
5.1.2
PURR
ALS
STRUKTURMODELL
FUER
CCPA
.
64
5.1.3
CCPAS
AUS
VERSCHIEDENEN
ORGANISMEN
BILDEN
EINE
SUBFAMILIE
.
65
5.1.4
INTERPRETATION
VON
CCPA-MUTANTEN
.
69
5.1.4.1
UNGERICHTETE
MUTANTEN
IN
CCPA
.
70
5.1.4.2
GERICHTETE
MUTANTEN
IN
CCPA
.
72
5.2
DIE
GRX-MUTANTEN
.
78
5.3
AKTUELLES
MODELL
DER
KATABOLITREPRESSION
IN
BACILLUS
MEGATERIUM
.
83
6
LITERATURVERZEICHNIS
.
87 |
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