Immunhistochemische Lokalisation der cGMP-stimulierten Phosphodiesterase:
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1998
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adam_text | ANGEFERTIGT MIT GENEHMIGUNG DER MATHEMATISCH-NATURWISSENSCHAFTLICHEN
FAKULTAET DER RHEINISCHEN FRIEDRICH-WILHELMS-UNIVERSITAET ZU BONN 1.
GUTACHTER: PRIVATDOZENT DR. MATTHIAS SCHRAMM 2. GUTACHTER: PROF. DR.
KLAUS MOHR TAG DER MUENDLICHEN PRUEFUNG: 28. JANUAR 1998 ICH VERSICHERE,
DASS ICH DIE VORLIEGENDE ARBEIT SELBSTAENDIG VERFASST UND NUR DIE
ANGEGEBENEN HILFSMITTEL VERWENDET HABE. INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS I ABKUERZUNGEN V HERKUNFT DER VERWENDETEN CHEMIKALIEN
UND ENZYME VTJ 1. EINLEITUNG 1 2. MATERIAL UND METHODEN 15
MOLEKULARBIOLOGISCHE GRUNDTECHNIKEN 2.1. LOESUNGEN UND MEDIEN 15 2.2.
ISOLIERUNG VON KLONEN AUS X-BIBLIOTHEKEN 20 2.2.1. BESCHREIBUNG DER
VERWENDETEN BIBLIOTHEKEN 20 2.2.2. TITERBESTIMMUNG DER VERWENDETEN
BIBLIOTHEKEN 20 2.2.3. AUSPLATTIEREN VON X-PHAGEN UND HERSTELLEN DER
FILTERABZUEGE 21 2.2.4. HYBRIDISIERUNG DER FILTERABZUEGE 21 2.2.5.
ISOLIERUNG VON KLONEN AUS ^.-BIBLIOTHEKEN 22 2.2.6. ISOLIERUNG VON X-DNA
AUS KLEINEN LYSATEN 22 2.2.7. DNA-ISOLIERUNG AUS X-ZAP H-KLONEN MITTELS
*IN VIVO-EXCISION 22 2.3. KLONIERUNG VON DNA 23 2.3.1. PRAEPARATION VON
KLONIERUNGSVEKTOREN 23 2.3.2. LIGATION 23 2.3.3. *TA-CLONING 23 2.3.4.
PRAEPARATION KOMPETENTER BAKTERIEN 24 2.3.5. TRANSFORMATION
/RETRANSFORMATION 24 2.4. ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON DNA 24 2.4.1.
RESTRIKTION DER DNA 24 2.4.2. DEPHOSPHORYLIERUNG 25 N INHALTSVERZEICHNIS
2.5. ISOLIERUNG VON DNA 2.5.1. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS
BAKTERIENKULTUREN 2.5.1.1. MINI-PLASMID-PRAEPARATION 2.5.1.2.
MAXI-PLASMID-PRAEPARATION 2.5.2. ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN 2.6.
GELELEKTROPHORESE DER DNA 2.7. RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA 2.7.1.
HERSTELLUNG RADIOAKTIVER SONDEN MITTELS NONANUKLEOTIDEN 2.7.2.
SEQUENZIERUNG VON DNA 2.8. TRANSFER VON DNA AUF NYLON-MEMBRANEN
(SOUTHEM-BLOTTING) 2.9. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 2.9.1.
STANDARD-PCR 2.9.2. SCHNELLE AMPLIFIKATION VON CDNA-ENDEN (RACE) 2.10.
AUTORADIOGRAPHIE PROTEINCHEMISCHE METHODEN 2.11. EXPRESSION UND
REINIGUNG BAKTERIELLER FUSIONSPROTEINE 2.11.1. INDUKTION KLEINER
KULTUREN 2.11.2. PRUEFUNG AUF LOESLICHKEIT 2.11.3. INDUKTION GROSSER
KULTUREN 2.11.4. REINIGUNG BAKTERIELLER FUSIONSPROTEINE 2.12.
DISKONTINUIERLICHE SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 25 25 25 26 26 27
27 27 27 28 28 28 29 29 30 30 30 30 31 31 INHALTSVERZEICHNIS M
IMMUNOLOGISCHE METHODEN 2.13. GEWINNUNG POLYKLONALER ANTISEREN 32 2.14.
REINIGUNG POLYKLONALER ANTISEREN 32 2.15. ELISA 33 2.16. TRANSFER VON
PROTEINEN AUF NITROZELLULOSE-MEMBRANEN (WESTERN- BLOTTING) 34 2.17.
IMMUNHISTOCHEMISCHE FAERBUNG VON GEWEBESCHNITTEN 34 2.17.1. BESCHICHTEN
VON OBJEKTTRAEGERN 34 2.17.2. ORGANPRAEPARATION FUER DIE IMMUNHISTOCHEMIE
35 2.17.3. ANFERTIGUNG VON GEWEBESCHNITTEN 35 2.17.4.
ANTIKOERPER-HYBRIDISIERUNG 35 3. ERGEBNISSE 37 3.1. GEWINNUNG VON
ANTI-PDE 2 ANTISEREN 3 7 3.1.1. KONSTRUKTION DER EXPRESSIONSPLASMIDE 38
3.1.2. INDUKTION UND AUFREINIGUNG 39 3.1.3. IMMUNISIERUNG UND GEWINNUNG
VON ANTISEREN 39 3.1.4. CHARAKTERISIERUNG DER ANTISEREN PER ELISA 40
3.1.5. REINIGUNG DER ANTISEREN 41 3.1.6. WESTE/TI-BLOT-ANALYSEN 43 3.2.
IMMUNHISTOCHEMISCHE LOKALISATION DER PDE 2 IN ORGANEN UND GEWEBEN 46
3.2.1. IMMUNHISTOCHEMISCHE FAERBUNG AN GEWEBESCHNITTEN 46 3.2.2.
UNTERSUCHUNGEN AN DER NEBENNIERE 47 3.2.2.1. LOKALISATION DER PDE 2 IN
DER NEBENNIERE 47 3.2.2.2. SPEZIESSPEZIFITAET 50 3.2.3. LOKALISATION DER
PDE 2 IM HERZ UND IN BLUTGEFAESSEN 51 3.2.4. LOKALISATION DER PDE 2 IM
UROGENITALTRAKT 53 3.2.5. LOKALISATION DER PDE 2 IM GEHIRN 56 TV
INHALTSVERZEICHNIS 3.3. KLONIERUNG EINER HUMANEN PDE 2 67 4. DISKUSSION
77 4.1. AUSSAGEKRAFT IMMUNHISTOCHEMISCHER ERGEBNISSE 79 4.2.
BETRACHTUNGEN ZUM VERGLEICH DER ERGEBNISSE AUF EBENE VON PROTEIN UND
MRNA 81 4.3. LOKALISATION DER PDE 2 IN DER NEBENNIERE 84 4.4.
LOKALISATION DER PDE 2 IM HERZ UND IN BLUTGEFAESSEN 87 4.5. LOKALISATION
DER PDE 2 IM UROGENITALTRAKT 90 4.6. LOKALISATION DER PDE 2 IM GEHIRN 94
4.7. KLONIERUNG EINER HUMANEN PDE 2 103 5. ZUSAMMENFASSUNG 105 6.
LITERATURVERZEICHNIS 107 7. ANHANG 127 7.1. LISTE DER VERWENDETEN
PCR-PRIMER 127 7.2. LISTE DER SEQUENZIERUNGSPRIMER 128
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