Untersuchung der In-vivo-Funktion des TNF-R55-assoziierten Proteins FAN: Generierung eines FAN-defizienten Mausstammes durch Inaktivierung des FAN-Gens mittels homologer Rekombination
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Utz, Wiss.
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INHALTSVERZEICHNIS
1
INHALTSVERZEICHNIS
1
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
4
1
ZUSAMMENFASSUNG
5
2
EINLEITUNG
7
2.1
D
ER
T
UMOR
N
EKROSE
F
AKTOR
7
2.2
S
IGNALTRANSDUKTION
VON
TNF
11
2.3
D
IE
F
AMILIE
DER
WD-40
REPEAT
P
ROTEINE
14
2.4
T
RANSGENE
T
IERMODELLE
IN
DER
U
NTERSUCHUNG
DER
S
IGNALTRANSDUKTION
16
2.5
F
RAGESTELLUNG
UND
Z
IEL
DER
A
RBEIT
19
3
MATERIAL
UND
METHODEN
20
3.1
M
ATERIAL
20
3.1.1
C
HEMIKALIEN
UND
E
NZYME
20
3.1.2
E
NZYME
20
3.1.3
S
YNTHETISCHE
O
LIGONUKLEOTIDE
21
3.1.4
S
ONSTIGES
22
3.1.5
P
LASMIDE
22
3
1.6
B
IOLOGISCHE
R
EAGENZIEN
22
3.1.7
B
AKTERIEN
22
3.1.8
H
EFEVEKTOREN
22
3.1
9
Z
ELLKULTUR
UND
Z
ELLINIEN
23
3.1.10
V
ERSUCHSTIERE
24
3.2
M
OLEKULARBIOLOGISCHE
A
RBEITSMETHODEN
24
3.2.1
I
SOLIERUNG
VON
P
LASMID
-DNA
24
3.2.2
I
SOLIERUNG
CHROMOSOMALER
DNA
24
3.2.3
I
SOLIERUNG
VON
P
LASMID
-DNA
AUS
H
EFEN
25
3.2.4
DNA/DNA-H
YBRIDISIERUNG
(S
OUTHERNBLOT
)
25
3.2.5
RNA-A
NALYSE
(N
ORTHERNBLOT
)
26
3
2.6
S
EQUENZANALYSE
26
2
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.7
F
LUORSZENZ
-
IN
-
SITU
-H
YBRIDISIERUNG
(FISH)
27
3.2.8
F
AERBUNG
CHROMOSOMALER
B
ANDEN
28
3.2.9
K
LONIERUNG
DES
R
EKOMBINATIONSVEKTORS
28
3.2.10
K
LONIERUNGSSTRATEGIE
28
3.2.11
P
LASMIDKONSTRUKTION
29
3.3
B
IOCHEMISCHE
M
ETHODEN
30
3.3.1
B
ESTIMMUNG
DER
A
KTIVITAET
DER
NEUTRALEN
S
PHINGOMYELINASE
(
N
SM
ASE
)
30
3.4
I
MMUNOLOGISCHE
M
ETHODEN
30
3.4.1
U
NTERSUCHUNG
DER
ZYTOTOXISCHEN
A
KTIVITAET
VON
NK-Z
ELLEN
30
3.5
Z
ELLKULTUR
31
3.5.1
K
ULTUR
VON
ES/EF-Z
ELLEN
31
3.5.2
E
LEKTROPORATION
31
3.5.3
S
ELEKTION
REKOMBINANTER
ES-Z
ELLKLONE
31
3.6
T
IERVERSUCHE
32
3.6.1
G
ENERIERUNG
CHIMAERER
B
LASTOZYSTEN
32
3.6.2
O
RGANENTNAHMEN
33
3.6.3
S
UPEROVULATION
33
3.6.4
G
EWINNUNG
EMBRYONALER
F
IBROBLASTEN
33
3.6.5
B
ESTIMMUNG
DER
B
LUTUNGSZEIT
34
3.6.6
B
ESTIMMUNG
DER
PARTIELLEN
T
HROMBOPLASTINZEIT
(PTT)
UND
Q
UICK
-T
EST
34
4
ERGEBNISSE
35
4.1
K
LONIERUNG
DER
MURINEN
FAN
CDNA
35
4.1.1
I
SOLIERUNG
VON
C
DNA-K
LONEN
AUS
EINER
P
HAGENBANK
35
4.1.2
SEQUENZIERUNG
DER
KLONE
UND
IDENTITAETSNACHWEIS
35
4.1.3
ISOLIERUNG
EINER
YYVOLLE
LAENGE
"
-CDNA
36
4.2
C
HARAKTERISIERUNG
DER
MURINEN
FAN
CDNA
39
4.2.1
U
NTERSUCHUNG
DER
H
OMOLOGIE
ZWISCHEN
HUMANEM
UND
MURINEM
FAN
39
4.2.2
E
XPRESSIONSSTUDIE
DURCH
N
ORTHERN
-A
NALYSE
40
4.2.3
U
NTERSUCHUNG
DES
T
RANSLATIONSSTARTS
AUF
K
ONSENSUSSEQUENZEN
41
4.3
D
ATENBANKVERGLEICHE
DER
FAN
C
DNA-S
EQUENZ
UND
I
DENTIFIZIERUNG
FUNKTIONELLER
D
OMAENEN
42
4.3.1
I
DENTIFIZIERUNG
DER
BEACH-D
OMAENE
42
4.4
C
HROMOSOMALE
L
OKALISIERUNG
DES
HUMANEN
FAN-G
ENS
45
INHALTSVERZEICHNIS
3
4.4
1
L
OKALISIERUNG
DURCH
F
LUORESZENZ
-
IN
-
SITU
-H
YBRIDISIERUNG
(FISH)
45
4.4
2
L
OKALISIERUNG
DURCH
PCR-A
NALYSE
VON
YAC-K
LONEN
47
4.5
K
LONIERUNG
DES
GENOMISCHEN
L
OKUS
VON
FAN
IN
DER
M
AUS
50
451
I
SOLIERUNG
GENOMISCHER
K
LONE
AUS
EINER
P
HAGENBANK
50
4.6
U
NTERSUCHUNG
UND
K
ARTIERUNG
DES
MURINEN
G
ENLOKUS
VON
FAN
50
4.6.1
R
ESTRIKTIONSKARTIERUNG
,
S
OUTHERN
-A
NALYSE
UND
L
OKALISIERUNG
DER
E
XON
/
INTRON
-
UEBERGAENGE
50
4.7
G
ENERIERUNG
EINES
FAN
D
EFIZIENTEN
M
AUSSTAMMES
52
4.7.1
K
LONIERUNGSSTRATEGIE
52
4.7.2
G
ENERIERUNG
HETEROZYGOTER
FAN
DEFIZIENTER
EMBRYONALER
S
TAMMZELLINIEN
DURCH
HOMOLOGE
R
EKOMBINATION
53
4.7.3
G
ENERIERUNG
EINES
GENDELETIERTEN
M
AUSSTAMMES
55
4.8
P
HAENOTYPANALYSE
FAN
DEFIZIENTER
M
AEUSE
60
4.8.1
H
ISTOLOGISCHE
UND
DURCHFLUSZYTOMETRISCHE
U
NTERSUCHUNGEN
60
4.8.2
B
IOCHEMISCHE
U
NTERSUCHUNGEN
62
4.8.3
F
UNKTIONELLE
U
NTERSUCHUNGEN
64
5
DISKUSSION
68
5.1
D
IE
MODULARE
S
TRUKTUR
DES
FAN
P
ROTEINS
68
5.2
D
IE
CHROMOSOMALE
L
OKALISATION
DES
FAN-G
ENS
70
5.3
G
ENERIERUNG
EINES
FAN
DEFIZIENTEN
M
AUSSTAMMES
72
5.4
U
NTERSUCHUNG
DER
IN
VIVO
F
UNKTION
VON
FAN
73
5.5
A
KTIVIERUNG
DER
NEUTRALEN
S
PHINGOMYELINASE
DURCH
TNF
IN
P
RIMAERKULTUREN
74
5.6
U
NTERSUCHUNG
DER
FAN
ABHAENGIGEN
K
OAGULOPATHIE
74
5.7
U
NTERSUCHUNG
DER
NK-A
KTIVITAET
VON
FAN
DEFIZIENTEN
M
ILZZELLEN
76
6
LITERATUR
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF
78
89
90 |
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