Klonierung und Charakterisierung einer neuen Protein-Serin-Threoninkinase (SNRK), die in 3T3-L1-Zellen differentiell exprimiert wird:
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| Published: |
Aachen
Shaker
1998
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| Edition: | Als Ms. gedr. |
| Series: | Berichte aus der Biologie
|
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| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Item Description: | Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 1998 |
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I
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1
EINLEITUNG
1
1.1
PROTEINKINASEN
UND
IHRE
BEDEUTUNG
IN
DER
INTRAZELLULAEREN
SIGNALTRANSDUKTION
1
1.2
3T3-LL-ZELLEN
ALS
MODELL
4
1.3
ZIELSETZUNG UND
VORGEHENSWEISE
5
2
MATERIAL
UND
METHODEN
7
2.1
GRUNDTECHNIKEN
7
2.1.1
STERILISIERUNG
7
2.1.2
AGARPLATTEN
FUER
BAKTERIENKULTUREN
7
2.1.3
PHENOL/CHLOROFORMEXTRAKTION
7
2.1.4
ETHANOLFAELLUNG
7
2.1.5
PRAEPARATION
DNASE-FREIER
RNASE
7
2.1.6
ERZEUGUNG
STUMPFER
DNA-ENDEN
8
2.1.7
PHOSPHORYLIERUNG
MIT
T4-KINASE
8
2.1.8
PHOSPHATASEREAKTION
8
2.1.9
LIGATION
8
2.1.10
TRANSFORMATION
9
2.1.11
RESTRIKTIONSVERDAUE
9
2.1.12
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
9
2.2
CDNA-SYNTHESE
9
2.3
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
10
2.4
LIGATION
IN
KLONIERUNGSVEKTOR
PBS
KS+
12
2.5
METHODEN
ZUR
PRAEPARATION
VON
DNA
13
2.5.1
MINIPRAEPARATIONEN
VON
PLASMIDEN
13
2.5.2
PRAEPARATION
GROESSERER
PLASMID-DNA-MENGEN
13
2.5.3
PRAEPARATION
VON
PHAGEN-DNA
13
2.6
ELEKTROPHORESEN
14
2.6.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
14
2.6.2
POLYACRYLAMIDGELELEKTROHORESE
(SDS-PAGE)
14
2.7
BLOTTING-METHODEN
15
2.7.1
KOLONIENBLOTS
15
2.7.2
SOUTHEM-BLOTS
15
2.7.3
NORTHEM-BLOTS
15
2.7.4
PHAGENPLAQUE-BLOTS
16
II
2.8
HYBRIDISIERUNGEN
16
2.8.1
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
16
2.8.2
HYBRIDISIERUNG
VON
KOLONIEN-BLOTS
17
2.8.3
SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG
17
2.8.4
NORTHERN-HYBRIDISIERUNG
18
2.8.5
ABWASCHEN
ALTER
SONDEN
18
2.9
DNA-SEQUENZIERUNG
18
2.9.1
PRIMER
18
2.9.2
SEQUENZREAKTIONEN
18
2.9.3
SEQUENZGEL
19
2.9.4
DELETIONEN
19
2.9.5
ULTRASCHALLFRAGMENTIERUNG
20
2.10.
DATENBANKSUCHE
20
2.11
ISOLIERUNG
EINES
PLAQUES
AUS
CDNA-BANK
21
2.12
EXPRESSION
EINES
PROTEINS
UND
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
KINASEAKTIVITAET
21
2.12.1
UMKLONIERUNG
IN
EXPRESSIONSVEKTOR
21
2.12.2
EXPRESSION
UND
ISOLIERUNG
DES
FUSIONSPROTEINS
23
2.12.3
IN-VI/RO-KINASE-ASSAY
24
3
ERGEBNISSE
25
3.1
KLONIERUNG
VON
PROTEIN-SERIN/THREONINKINASEFRAGMENTEN
24
3.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
PROTEINKINASEN
SNRK
26
3.2.1
ISOLIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DER
CDNA
CON
SNRK
26
3.2.2
DIE
SEQUENZ
VON
SNRK
28
3.2.3
SEQUENZAEHNLICHKEITEN
VON
SNRK
ZU
ANDEREN
KINASEN
32
3.2.4
NORTHERN-HYBRIDISIERUNGEN
MIT
SNRK
38
3.2.5
KATALYTISCHE
AKTIVITAET
VON
REKOMBINANTER
SNRK
IN
VITRO
40
3.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
ANDEREN
NACH
PCR-KLONIERUNG
ISOLIERTEN
FRAGMENTE
42
3.3.1
SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG
42
3.3.2
DIFFERENTIELLE
PCR-SCREENING-UNTERSUCHUNGEN
42
3.3.3
DIE
PCR-KLONE
IM
EINZELNEN
44
4
DISKUSSION
53
4.1
SNRK
IST
EINE
SERIN/THREONINKINASE,
DIE
DIFFERENTIELL
EXPRIMIERT
WIRD
53
UND
IN
VIVO
MOEGLICHERWEISE
INSULINREGULIERT
IST
4.2
SNRK
BESITZT
ENINIGE
SEQUENZMOTIVE,
DIE
FUER
DIE
FUNKTION
IN
VIVO
VON
53
BEDEUTUNG
SEIN
KOENNEN
III
4.3
DIE
PCR
IST
EINE
GEEIGNETE
METHODE
ZUR
AMPLIFIKATION
VON
KINASEFRAGMENTEN
55
4.4
DIE
PCR-KLONE
KOENNEN
DURCH
EXPRESSIONSUNTERSUCHUNGEN
CHARAKTERISIERT
WERDEN
56
5
ZUSAMMENFASSUNG
58
6
LITERATURVERZEICHNIS
60
ANHANG
72 |
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