Genregulatoren der Penicillin-Biosynthese in Aspergillus nidulans:
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
EINLEITUNG
.
1
1.
BIOSYNTHESE
VON
PENICILLIN,
BETEILIGTE
ENZYME,
KODIERENDE
GENE
.
2
2.
DIE
REGULATION
DER
PENICILLIN-BIOSYNTHESE
.
6
2.1
GENERELLE
REGULATIONSMUSTER
BEI
DER
EXPRESSION
DER
PENICILLIN-BIOSYNTHESEGENE
.
6
2.2
EINFLUSS
DER
KOHLENSTOFF-QUELLE
.
7
2.3
EINFLUSS
DER
STICKSTOFF-QUELLE
.
8
2.4
EINFLUSS
DES
PH-WERTES
.
9
2.5
REGULATORISCHE
EINFLUESSE
VERSCHIEDENER
AMINOSAEUREN
.
10
2.6
REGULATION
UEBER
WEITERE
POTENTIELLE
REGULATORPROTEINE
.
11
3.
ZIEL
DIESER
ARBEIT
.
12
MATERIAL
UND
METHODEN
I.
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
.
13
1.
BAKTERIENSTAEMME,
PILZSTAEMME,
PLASMIDE
.
13
2.
NAEHRMEDIEN
.
16
3.
ANZUCHTBEDINGUNGEN
.
17
4.
HERSTELLUNG
VON
SPORENSUSPENSIONEN
.
18
5.
DURCHFUEHRUNG
SEXUELLER
KREUZUNGEN
.
18
6.
BESTIMMUNG
DES
PENICILLIN-TITERS
.
18
II.
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
.
18
1.
METHODEN
ZUR
ISOLIERUNG
VON
DNA
.
18
1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
.
18
1.2
ISOLIERUNG
CHROMOSOMALER
DNA
VON
FILAMENTOESEN
PILZEN
.
19
1.3
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
19
2.
ENZYMATISCHE
METHODEN
ZUR
MODIFIKATION
VON
DNA
.
19
2.1
AMPLIFIKATION
VON
DNA
MITTELS
PCR
.
19
2.2
ENZYMATISCHE
IN
VITRO-REAKTIONEN
MIT
DNA
.
20
2.3
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
20
3.
DNA/DNA-HYBRIDISIERUNG
.
20
3.1
YYSOUTHEM
"
-HYBRIDISIERUNG
.
20
3.2
KOLONIE-HYBRIDISIERUNG
.
20
4.
EINFUEHRUNG
SPEZIFISCHER
MUTATIONEN
IN
DNA
.
21
5.
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.
21
6.
ELEKTROPHORESE
VON
DNA
.
21
6.1
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
IN
AGAROSEGELEN
.
21
6.2
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
IN
HAMSTOFFTPOLYACRYLAMIDGELEN
.
21
6.3
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
IN
NICHT-DENATURIERENDEN
POLYACRYLAMIDGELEN
.
22
7.
TRANSFORMATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
.
22
8.
TRANSFORMATION
VON
ASPERGILLUS
NIDULANS
.
22
9.
LISTE
DER
VERWENDETEN
OLIGONUKLEOTIDE
.
22
III.
STANDARDMETHODEN
ZUR
ANALYSE
VON
PROTEINEN
.
24
1.
ELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
.
24
2.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
24
3.
BESTIMMUNG
DER
RELATIVEN
MOLEKIIHNASSE
DURCH
GELFILTRATION
.
24
IV.
SPEZIELLE
BIOCHEMISCHE
METHODEN
.
25
1.
ENZYMATISCHE
METHODEN
.
25
1.1
BESTIMMUNG
DER
SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET
.
25
1.2
BESTIMMUNG
DER
SS-GLUCURONIDASE-AKTIVITAET
.
25
2.
ANALYSE
VON
DNA-PROTEIN-INTERAKTIONEN
.
25
2.1
GELRETARDATIONS-EXPERIMENT
(YYBAND
STUFT
"
)
.
25
2.2
QUANTITATIVE,
DIFFERENTIELLE
GELRETARDATION
.
26
3.
REISOLIERUNG
VON
PROTEINEN
AUS
EINEM
DENATURIERENDEN
POLYACRYLAMIDGEL
(SDS-PAG)
.
26
4.
UEBERPRODUKTION
VON
PROTEINEN
.
27
4.1
UEBERPRODUKTION
IN
E.
COLI
UND
GEWINNUNG
VON
PROTEINEXTRAKTEN
.
27
4.2
UEBERPRODUKTION
IN
A.
NIDULANS
.
27
V.
REINIGUNG
VON
PROTEINEN
.
28
1.
HERSTELLUNG
VON
ROHEXTRAKTEN
VON
A.
NIDULANS
.
28
2.
REINIGUNG
DURCH
HEPARIN-AGAROSE-CHROMATOGRAPHIE
.
28
3.
REINIGUNG
DURCH
ANIONEN-AUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
.
28
4.
REINIGUNG
DURCH
HYDROXYL-APATIT-CHROMATOGRAPHIE
.
29
5.
REINIGUNG
DURCH
DNA-AFFINITAETS-CHROMATOGRAPHIE
.
29
6.
REINIGUNG
DURCH
AMYLOSE-AFFINITAETS-CHROMATOGRAPHIE
.
30
VI.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
30
VII.
BERECHNUNG
DES
BIEGEWINKELS
.
31
VIII.BEZUGSQUELLEN
BESONDERER
ENZYME
UND
CHEMIKALIEN
.
31
ERGEBNISSE
33
I.
IDENTIFIZIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINES
EIS-AKTIVEN
DNA
ELEMENTES
IM
PROMOTORBEREICH
DES
AAT-GENS
:
BINDUNG
VON
PENR1
AN
EINE
CCAAT-ENTHALTENDE
DNA-SEQUENZ
.33
1.
SUCHE
NACH
DNA-BINDENDEN
PROTEINEN,
DIE
MIT
DER
PROMOTORREGION
DES
OAR-GENS
INTERAGIEREN
.
33
2.
IDENTIFIZIERUNG
EINER
ERKENNUNGSSEQUENZ
FUER
EIN
DNA-BINDENDES
PROTEIN
(PENR1)
IM
AAR-PROMOTOR
.
34
2.1
EINGRENZUNG
DER
BINDESTELLE
.
34
2.2
SPEZIFITAETSNACHWEIS
FUER
DIE
BINDUNG
DES
PROTEINS/PROTEINKOMPLEXES
(PENR1)
AN
EIN
200
BP-LANGES
DNA-FRAGMENT
UND
IDENTIFIZIERUNG
EINER
FUNKTIONALEN
CCAAT
BINDESTELLE
.
35
3.
UNTERSUCHUNG
DES
UEBER
DIE
CCAAT-BOX
VERMITTELTEN
EFFEKTES
AUF
DIE
EXPRESSION
DES
AAT-GENS
.
40
4.
NACHWEIS
DER
BINDUNG
VON
PENR1
IM
PROMOTORBEREICH
DER
GENE
ACVA
UND
IPNA
.
42
5.
WEITERE
CHARAKTERISIERUNG
DER
CCAAT-BINDESTELLE
.
44
6.
STUDIEN
ZUR
BINDUNG
VON
PENR1
AN
DEN
OAT-PROMOTOR
VON
PENICILLIUM
CHRYSOGENUM
.
46
II.
CHARAKTERISIERUNG
VON
PENR1
:
PENR1
IST
EIN
PROTEINKOMPLEX
DES
HAP-TYPS
.
49
1.
PARTIELLE
REINIGUNG
VON
PENR1
.
49
2.
WEITERGEHENDE
EINGRENZUNG
DER
KOMPONENTEN
VON
PENR1
DURCH
REISOLIERUNG
AUS
EINEM
SDS-PAG
.
52
3.
IDENTIFIZIERUNG
VON
HAPC
IM
AFFINITAETSGEREINIGTEN
PROTEINEXTRAKT
.
53
4.
EIN
AHAPC-STAMM
BESITZT
KEINE
PENR
1
-DNA-BINDEAKTIVITAET
.
54
5.
DIREKTER
NACHWEIS
VON
HAPC
ALS
TEIL
VON
PENR1
.
56
6.
EXPRESSION
DER
PENICILLIN-BIOSYNTHESEGENE
UND
PENICILLIN-PRODUKTION
IN
EINEM
AHAPC-STAMM
.
57
7.
ANALYSE
VON
CCAAT-BOXEN
IN
PROMOTERBEREICHEN
WEITERER
GENE
AUF
BINDUNG
DURCH
PENR
1
.
59
8.
BIEGUNG
DER
DNA
DURCH
PENR1
.
62
9.
KLONIERUNG
VON
HAPB,
EINER
WEITEREN
POTENTIELLEN
KOMPONENTE
EINES
HAP
KOMPLEXES
VON
A.
NIDULANS
.
64
III.
IDENTIFIZIERUNG,
UEBERPRODUKTION
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINES
WEITEREN
REGULATORPROTEINS
:
DAS
BHLH-PROTEIN
PENR2
REGULIERT
DIE
EXPRESSION
DES
PENICILLIN-BIOSYNTHESEGENS
AAT
.
69
1.
IDENTIFIZIERUNG
WEITERER
DNA-BINDENDER
PROTEINE
.
69
1.1
DIFFERENTIELLE,
QUANTITATIVE
GELRETARDATIONS
ANALYSE
.
69
1.2
DIFFERENTIELLE
BANDENANALYSE
UEBER
DNA-AFFINITAETS-CHROMATOGRAPHIE
.
71
2.
QUANTITATIVE
REINIGUNG
UND
IDENTIFIZIERUNG
POTENTIELLER
DNA-BINDEPROTEINE
.
73
3.
BESTIMMUNG
VON
AMINOSAEURESEQUENZEN
DER
GEREINIGTEN
PROTEINE
.
75
4.
IDENTIFIZIERUNG
DER
KORRESPONDIERENDEN
DNA-SEQUENZ
EINES
DNA-BINDENDEN
PROTEINS
.
75
4.1
ISOLIERUNG
DES
ENTSPRECHENDEN
GENS
UEBER
EINEN
PCR-ANSATZ
MIT
DEGENERIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
75
4.2
BESTIMMUNG
DER
CDNA
UND
DER
GENOMISCHEN
DNA-SEQUENZ
VON
PROTEIN
NR.
3
(PENR2)
.
76
4.3
ANALYSE
DER
SEQUENZ
.
78
5.
UEBERPRODUKTION
VON
PENR2
IN
E.
COLI
UND
REINIGUNG
ALS
MALE-FUSION
.
79
5.1
KLONIERUNG
DES
PENR2-GENS
IN
DAS
UEBERPRODUKTIONSPLASMID
PMAL-C2
.
79
5.2
UEBERPRODUKTION
UND
REINIGUNG
VON
PENR2
.
79
6.
IN
VUERO-BINDUNGSSTUDIEN
MIT
DEM
UEBERPRODUZIERTEN
PROTEIN
PENR2
.
81
6.1
NACHWEIS
DER
BINDUNG
VON
PENR2
IN
VITRO
.
81
6.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
SPEZIFITAET
DER
DNA-PROTEIN-INTERAKTION
.
82
6.3
NACHWEIS
DER
BINDUNG
VON
ZWEI
MOLEKUELEN
PENR2
AN
EIN
UND
DIESELBE
DNA
.
85
7.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
DNA-BINDUNGSVERHALTEN
VON
PENR1
UND
PENR2
.
87
8.
VERSUCHE
ZUR
INAKTIVIERUNG
DES
PENR2-GENS
.
89
8.1
GENERATION
EINES
YYKNOCK
OUT
"
-KONSTRUKTES
.
89
8.2
TRANSFORMATION
VON
A.
NIDULANS
UND
SUCHE
NACH
YYKNOCK
OUT
"
-STAEMMEN
.
90
9.
UEBERPRODUKTION
VON
PENR2
IN
A.
NIDULANS
.
91
9.1
KLONIERUNGSSTRATEGIE
UND
TRANSFORMATION
VON
A.
NIDULANS
.
91
9.2
EXPRESSION
DER
PENICILLIN-BIOSYNTHESEGENE
UND
PENICILLIN-TITER
BEI
UEBERPRODUKTION
VONPENR2
.
92
9.3
WACHSTUMSVERHALTEN
DER
STAEMME
MIT
FUSIONSPLASMID
.
95
DISKUSSION
.
97
ZUSAMMENFASSUNG
.
113
LITERATURVERZEICHNIS
.
115 |
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