Permeabilität und Biogenese von Peroxisomen: Charakterisierung beteiligter Membrankomponenten
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS:
1. EINLEITUNG.1
2. MATERIAL:.9
2.1. CHEMIKALIEN.9
2.2. SPEZIELLE CHEMIKALIEN.9
2.3. REAGENTIENSAETZE (KITS).11
2.4. NUKLEINSAEUREN.12
2.4.1. VEKTOREN.12
2.5. ENZYME.13
2.6. BAKTERIENSTAEMME UND ZELLINIEN.13
2.7. RADIOAKTIVES MATERIAL.YY.14
2.8. ANTIKOERPER.14
2.9. VERSUCHSTIERE.15
3. METHODEN.16
3.1. BIOCHEMISCHE METHODEN. 16
3.1.1. ISOLIERUNG VON PEROXISOMEN.16
3.1.1.1. HOMOGENISATION DER RATTENLEBER UND DIFFERENZIELLE
ZENTRIFUGATION.16
3.1.1.2. NYCODENZ- UND PERCOLL-DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION.16
3.1.1.3. BESTIMMUNG DER KATALASEAKTIVITAET.18
3.1.2. PRAEPARATION VON MEMBRAN UND MATRIXPROTEINEN MIT DER
CARBONATMETHODE.18
3.1.3. GELYSTEME:.19
3.1.3.1. PROTEINTRENNUNG DURCH SDS-PAGE.19
3.1.3.2. AGAROSEGEL:.20
3.1.3.3. SEQUENZIERGELE.20
3.1.4. AUTORADIOGRAPHIE/FLUOROGRAPHIE.21
3.1.5. IMMUNPRAEZIPITATION.21
3.1.6. BESTIMMUNG DER SACCHAROSE- BZW. WASSERBINDUNGSKAPAZITAET VON
PEROXISOMEN.22
L
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/952757079
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.7. WESTEMBLOT (IMMUNOBLOT).23
3.1.8. COATOMER BINDUNGSTEST MIT IMMOBILISIERTEN, SYNTHETISCHEN
PEPTIDEN. 23
3.2. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN.25
3.2.1. RT-PCR (REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION).25
3.2.1.1. ISOLATION VON MRNA AUS RATTENLEBER.25
3.2.1.2. REVERSE TRANSKRIPTION DER MRNA.25
3.2.1.3. POLYMERASE KETTEN (CHAIN) REAKTION (PCR).26
3.2.1.4. ANALYSE DER PCR AMPLIFIKATIONSPRODUKTE.27
3.2.2. KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN UND UMKLONIERUNG VON PMP26.28
3.2.2.1. EXTRAKTION VON DNA FRAGMENTEN AUS DEM AGAROSEGEL.28
3.2.2.2. KLONIERUNG MIT DEN PLASMIDVEKTOREN PGEM-T,
PBLUESCRIPTSK UND PCDNA3.29
3.2.2.3. TRANSFORMATION VON E. COLI XLL-BLUE.30
3.2.3. PLASMIDPRAEPARATION (MINIPRAEP, MIDIPRAEP).31
3.2.4. SEQUENZIERUNG VON DNA. 31
3.2.5. DURCHSUCHEN (SCREEN) EINER CDNA-BANK.32
3.2.6. IN VITRO TRANSKRIPTION UND TRANSLATION VON PMP26.33
3.2.6.1 KO- UND POSTTRANSLATIONALE INSERTION VON PMP26 IN
HUNDEPANKREAS-MIKROSOMEN BZW. PEROXISOMEN.33
3.3. ZELLBIOLOGISCHE METHODEN.
34
3.3.1. ZELLKULTUR VON CHO UND AT3 ZELLEN.34
3.3.2. LIPOFEKTION MIT DOTAP.35
3.3.3. MIKROSKOPISCHE TECHNIKEN.35
3.3.3.1. IMMUNFLUORESZENZ.35
3.3.3.2. ELEKTRONENMIKROSKOPIE.37
3.4. HERSTELLUNG VON ANTISEREN.37
3.4.1. ELISA.
38
4. ERGEBNISSE.
4.1. BEEINFLUSSUNG DER GLEICHGEWICHTSDICHTE VON PEROXISOMEN.39
4.1.1. SPEZIFITAET DES NEM EFFEKTS.
41
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.1.1. DIE SH-REAKTIVITAET VON NEM.41
4.1.1.2. KONZENTRATIONSABHAENGIGKEIT DES NEM EFFEKTS.43
4.1.2. WIRKUNG ANDERER SH-REAKTIVER SUBSTANZEN AUF DIE GLEICHGEWICHTS
DICHTE VON PEROXISOMEN.44
4.1.2.1. VERWENDUNG VON THIOLOXIDIERENDEN SUBSTANZEN UND DISULFIDEN. 45
4.1.2.1.1. BEEINFLUSSUNG DER GLEICHGEWICHTSDICHTE VON PEROXISOMEN
DURCH BEHANDLUNG MIT GLUTATHIONDISULFID.46
4.1.2.1.1.1. KONZENTRATIONSABHAENGIGKEIT DES DURCH GSSG
HERVORGERUFENEN SHIFT-EFFEKTS.48
4.1.2.1.2. BEEINFLUSSUNG DER GLEICHGEWICHTSDICHTE VON PEROXISOMEN
MIT CYSTAMIN UND CYSTINDIMETHYLESTER.49
4.1.2.2. VERWENDUNG VON THIOLEN.52
4.1.2.2.1. EINFLUSS VON GLUTATHION AUF DIE GLEICHGEWICHTSDICHTE VON
PEROXISOMEN.52
4.1.2.2.2. UEBERPRUEFUNG DER NOTWENDIGKEIT EINER S-S BRUECKE IM
CYSTAMIN.55
4.1.3. VORBEHANDLUNG DER PEROXISOMEN.57
4.1.3.1. DESAKTIVIERUNG VON NEM INSENSITIVEN SH-GRUPPEN.57
4.1.3.2. LOKALISATION DER NEM SENSITIVEN SH-GRUPPEN MITTELS
PROTEASEBEHANDLUNG.58
4.1.3.3. REVERSIBILITAET DER GLEICHGEWICHTSDICHTEAENDERUNG.61
4.1.4. IDENTIFIZIERUNG DER NEM SENSITIVEN KOMPONENTE(N).62
4.1.4.1. PROTEINMARKIERUNG MIT
3H-NEM.62
4.1.4.2. IST PMP69 DIE NEM SENSITIVE KOMPONENTE?.64
4.1.4.2.1 PROTEINMARKIERUNG MIT
3H-NEM AN VORBEHANDELTEN
PEROXISOMEN.66
4.1.5. ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE DATEN.68
4.2. KLONIERUNG, SEQUENZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES 26 KDA
PEROXISOMALEN MEMBRANPROTEINS.70
4.2.1. PEPTIDINFORMATIONEN.70
4.2.2. RT-PCR.71
III
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.3. DURCHSUCHEN EINER RATTENLEBER CDNA BANK UND SEQUENZIERUNG DER
POSITIVEN PHAGENKLONE.73
4.2.4. KLONIERUNG DER CDNA VON PMP26 NACH PCR
AMPLIFIKATION MIT
SPEZIFISCHEN OLIGONUKLEOTIDPRIMEM.76
4.2.5. MOLEKULARE CHARAKTERISIERUNG VON PMP26.78
4.2.5.1. SEQUENZANALYSE.78
4.2.5.2. MEMBRANTOPOLOEGIE VON PMP26.80
4.2.5.3. GROESSENVERGLEICH DES IN VITRO TRANSLATIONSPRODUKTS VERSUS
ISOLIERTEM MEMBRANPROTEIN.83
4.2.5.4. VERGLEICH VON PMP26 MIT BEKANNTEN PROTEIN- UND DNA-
SEQUENZEN. 85
4.2.5.5. IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPISCHER NACHWEIS VON PMP26 IN
PEROXISOMEN.88
4.2.6. FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VON PMP26: DAS C-TERMINALE
KXKXX-MOTIV.88
4.2.6.1. COATOMER-BINDUNGSSTUDIEN MIT IMMOBILISIERTEN PEPTIDMUTANTEN
UND ISOLIERTEN PEROXISOMEN.89
4.2.6.2. COLOKALISATION VON COATOMER MIT PEROXISOMEN IN DER
SEMIPERMEABILISIERTEN ZELLE.91
4.2.6.3. UEBEREXPRESSION VON PMP26 IN CHO ZELLEN.94
5. DISKUSSION.
5.1. DIE BEEINFLUSSUNG DER GLEICHGEWICHTSDICHTE VON PEROXISOMEN UND DIE
BETEILIGUNG VON POREN.97
5.1.1. DIE GLEICHGEWICHTSDICHTE VON PEROXISOMEN.97
5.1.2. DIE ERNIEDRIGUNG DER GLEICHGEWICHTSDICHTE VON PEROXISOMEN DURCH
NEM.100
5.1.3. DIE IDENTIFIZIERUNG DER NEM SENSITIVEN KOMPONENTE.102
5.1.4. AENDERUNG DER GLEICHGEWICHTSDICHTE DURCH VERAENDERUNG DER
HYDRATATION DER MATRIX.104
5.1.5. AUSBLICK AUF DIE IDENTIFIZIERUNG PEROXISOMALER PORENPROTEINE.105
5.2. PMP26 UND SEINE FUNKTION IN DER PEROXISOMENMEMBRAN.107
5.2.1. SEQUENZINFORMATIONEN AUS DER CDNA VON PMP26.107
IV
INHALTSVERZEICHNIS
5.2.2. DIE HOMOLOGIE VON PMP26 ZU SCPMP27P.108
5.2.3. TOPOLOGIE UND TOPOGRAPHIE VON PMP26.109
5.2.4. MECHANISMUS DER NEUBILDUNG VON PEROXISOMEN.112
5.2.4.1. BINDUNG VON COATOMER AN PMP26.113
5.2.4.2. SPEZIFITAET DER COATOMERBINDUNG AN PEROXISOMEN.114
5.2.4.3. DIE ROLLE VON PMP26 BEI DER BIOGENESE VON PEROXISOMEN.114
6. ZUSAMMENFASSUNG.118
7. ABKUERZUNGEN:.119
8. LITERATURVERZEICHNIS.120
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