In-vitro-Untersuchungen zur Wirkung neuer Sensibilisatoren für die photodynamische Therapie von Hauterkrankungen:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1997
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/TV-F/JAEO-UNTERSUCHUNGEN ZUR WIRKUNG
NEUER SENSIBILISATOREN FUER DIE PHOTODYNAMISCHE THERAPIE VON
HAEUTERKRANKUNGEN
DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)
DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET III - BIOLOGIE UND VORKLINISCHE
MEDIZIN DER UNIVERSITAET REGENSBURG
VORGELEGT VON
SONJA FICKWEILER AUS WERNBERG-KOEBLITZ
1997
IMAGE 2
INHALT
INHALT
I EINLEITUNG
1 DIE PHOTODYNAMISCHE THERAPIE: DEFINITION UND HISTORISCHE ENTWICKLUNG 1
1.1 PRINZIP DER PHOTODYNAMISCHEN THERAPIE 1
1.2 GESCHICHTE UND GEGENWAERTIGE KLINISCHE BEDEUTUNG DER PDT 2
2 DER PHOTODYNAMISCHE WIRKUNGSMECHANISMUS 3
2.1 MOLEKUELPHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN 3
2.1.1 ABSORPTION VON LICHT 4
2.1.2 ENERGIERELAXATION 4
2.2 ENERGIEZUSTAENDE DES MOLEKULAREN SAUERSTOFF 5
2.3 PHOTOCHEMISCHE REAKTIONEN DER PDT 6
2.3.1 TYP-I-REAKTION . 6
2.3.2 TYP-N-REAKTION 6
2.4 ZYTOTOXIZITAET IN BIOLOGISCHEN SYSTEMEN 7
3 LICHTQUELLEN 9
4 PHOTOSENSIBILISATOREN 10
4.1 EIGENSCHAFTEN EINES IDEALEN PHOTOSENSIBILISATORS 10
4.2 NEUE ENTWICKLUNGEN 10
4.3 BEKANNTE EIGENSCHAFTEN DER VERWENDETEN SENSIBILISATOREN 11 4.3.1
INDOCYANINGRUEN (ICG) 11
4.3.2 9-ACETOXY-2,7,12,17-TETRAKIS-(SS-METHOXYETHYL)-PORPHYCEN (ATMPN) 13
4.3.3 2,4-DI-(A-METHOXYETHYL)-DEUTEROPORPHYRIN IX (DIMEGIN) 13 4.3.4
5-AMINOLAEVULINSAEURE (ALA) 13
4.3.5 PORPHYRIN-PLATIN-KOMPLEXE (K2 UND K12) 16
5 FRAGESTELLUNG 17
II MATERIAL UND METHODEN 18^
1 ZELLKULTUR 18
1.1 VERWENDETE ZELLINIEN 18
1.1.1 DIE KERATINOZYTENZELLINIE HACAT 18
1.1.2 DIE FIBROBLASTENZELLINIE NL 18
1.1.3 DIE PLATTENEPITHELKARZINOMZELLINIEN SCL1 UND SCL2 18 1.2
KULTIVIERUNG 19
1.3 ZELLGROESSENANALYSE 19
2 HERSTELLUNG DER SENSIBILISATORLOESUNGEN FUER DIE ZELLINKUBATION 19 2.1
VERWENDUNG VON LOESUNGSMITTELN 20
2.2 LIPOSOMALE LOESUNGEN 20
IMAGE 3
I N H A LT
2.3 BESTIMMUNG DER SPEKTROMETRISCHEN EIGENSCHAFTEN DER LOESUNGEN 20
3 PHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER ZELLULAEREN ICG-AUFNAHME 21
3.1 ABSORPTIONSSPEKTREN VON ZELLSUSPENSIONEN ICG-INKUBIERTER ZELLEN 21
3.2 ICG-AUFHAHME IN ABHAENGIGKEIT VON EXTRAZELLULAERER ICG-KONZENTRATION
UND INKUBATIONSZEIT 21
3.2.1 PROTOKOLL ZUR BESTIMMUNG DER ICG-AUFHAHME 21
3.2.2 BESTIMMUNG DER INTRAZELLULAEREN ICG-KONZENTRATION 21 3.3
ICG-AUFHAHME IN GEGENWART VON BROMSULFOPHTHALEIN (BSP) 22 3.3.1
PROTOKOLL ZUR BESTIMMUNG DER ICG-AUFHAHME IN GEGENWART VON BSP 22
3.3.2 ANALYSE DES INHIBITIONSTYPS MITTELS LINEWEAVER-BURK-PLOT 22
4 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER ZELLULAEREN AUFNAHME FUER
FLUORESZIERENDE PHOTOSENSIBILISATOREN 23
4.1 QUANTIFIZIERUNG DER ZELLULAEREN SENSIBILISATORFLUORESZENZ NACH
DEFINIERTER INKUBATIONSZEIT 23
4.1.1 PROTOKOLL ZUR BESTIMMUNG DER ZELLULAEREN SENSIBILISATORFLUORESZENZ
23
4.1.2 MESSUNG UND AUSWERTUNG 23
4.2 KURZZEITFLUORESZENZKINETIK 24
4.2.1 MESSPROTOKOLL UND AUSWERTUNG 24
4.2.2 TEMPERATURABHAENGIGKEIT DER FLUORESZENZKINETIK 24
5 FLUORESZENZMIKROSKOPIE UND INTRAZELLULAERE SENSIBILISATORLOKALISATION
25 5.1 FLUORESZENZMIKROSKOPIE 25
5.1.1 FLUORESZENZMIKROSKOP 25
5.1.2 KONFOKALES LASERRASTERMIKROSKOP 25
5.2 DARSTELLUNG DER SENSIBILISATOR- UND ORGANELLENVERTEILUNG 25 5.2.1
PRAEPARATION DER ZELLEN UND SENSIBILISATORINKUBATION 25 5.2.2
FLUORESZENZMARKIERUNG VON LYSOSOMEN UND MITOCHONDRIEN 26 5.2.3
SENSIBILISATOR-ORGANELLEN-DOPPELFARBUNGEN 26
6 LICHTQUELLEN ZUR PHOTODYNAMISCHEN BEHANDLUNG 26
6.1 DIODENLASER 26
6.2 INKOHAERENTE LICHTQUELLE 26
7 QUANTITATIVE UNTERSUCHUNGEN ZUR PDT-WIRKUNG 27
7.1 AUSTESTUNG DER PDT-WIRKUNG MITTELS MTT-TEST 27
7.1.1 PDT-PROTOKOLL 27
7.1.2 MTT-TESTPROTOKOLL 28
7.1.3 BESTIMMUNG DER EC50 28
7.2 QUENCHER-EXPERIMENT MIT NATRIUMAZID ZUR ANALYSE DER NACH PDT
ENTSTEHENDEN SAUERSTOFFSPEZIES 28
7.2.1 VERSUCHSPROTOKOLL 29
7.2.2 QUANTIFIZIERUNGDESQUENCHER-EFFEKTS 29
7.3 TRYPANBLAU-AUSSCHLUSSTEST UND WACHSTUMSKURVEN 29
7.3.1 PDT-PROTOKOLL 29
7.3.2 TRYPANBLAU-AUSSCHLUSSTEST 30
7.3.3 WACHSTUMSKURVEN UND BESTIMMUNG DER POPULATIONS- VERDOPPLUNGSZEIT
30
- U -
I N H A LT
8 QUALITATIVE UNTERSUCHUNGEN ZUR PDT-WIRKUNG 30
8.1 FLUORESZENZGESTUETZTE VERFAHREN 30
8.1.1 PDT-PROTOKOLL 31
8.1.2 FARBSTOFFAUSSCHLUSSTEST MIT PROPIDIUMJODID 31
8.1.3 IMMUNZYTOCHEMISCHE MARKIERUNG VON ZYTOSKELETTKOMPONENTEN 31 8.2
TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE 32
8.2.1 PDT-PROTOKOLL 32
8.2.2 PRAEPARATION FUER DIE ELEKTRONENMIKROSKOPIE 32
9 STATISTISCHE AUSWERTUNG UND UEBERSICHT 33
III ERGEBNISSE 35
1 SPEKTROMETRISCHE EIGENSCHAFTEN DER SENSIBILISATOREN 35
1.1 INDOCYANINGRIIN (ICG) UND PHOTOSAN-3 35
1.2 9-ACETOXY-2,7,12,17-TETRAKIS-(SS-METHOXYETHYL)-PORPHYCEN (ATMPN) 36
1.3 2,4-DI-(A-METHOXYETHYL)-DEUTEROPORPHYRIN LX (DIMEGIN) 37
2 SENSIBILISATORAUFHAHME 38
2.1 ICG-AUFHAHME 38
2.1.1 ABSORPTIONSSPEKTREN VON ZELLSUSPENSIONEN ICG-INKUBIERTER ZELLEN 38
2.1.2 ICG-AUFHAHME IN ABHAENGIGKEIT VON EXTRAZELLULAERER ICG-
KONZENTRATION UND INKUBATIONSZEIT 38
2.1.3 ICG-AUFHAHME IN GEGENWART VON BSP 40
2.2 AUFNAHME FLUORESZIERENDER SENSIBILISATOREN 41
2.2.1 AUFHAHMEKINETIK VON ATMPN IN ABHAENGIGKEIT VON LOESUNGSVERMITTLUNG
UND TEMPERATUR 41
2.2.2 ZELLULAERE FLUORESZENZINTENSITAET VON ATMPN, DIMEGIN UND PPIX IM
VERGLEICH DER ZELLINIEN 43
3 SENSIBILISATORLOKALISATION 44
3.1 INTRAZELLULAERE LOKALISATION VON ATMPN, DIMEGIN UND PPLX 44 3.2
DOPPELFAERBUNGEN MIT ORGANELLENSPEZIFISCHEN FARBSTOFFEN 44 3.3 VERGLEICH
DER SENSIBILISATORLOKALISATION DER VERSCHIEDENEN ZELLINIEN 48
4 AUSTESTUNG DER PDT-WIRKUNG 50
4.1 PHOTOSAN-3 (REFERENZPHOTOSENSIBILISATOR) 50
4.2 INDOCYANINGRUEN (ICG) 51
4.2.1 ABHAENGIGKEIT VON LICHTDOSIS UND INKUBATIONSZEIT 51
4.2.2 VERGLEICH DER ZELLINIEN 52
4.2.3 QUENCHER-EXPERIMENT (VERGLEICH MIT PHOTOSAN-3) 53 4.3
9-ACETOXY-2,7,12,17-TETRAKIS-(SS-METHOXYETHYL)-PORPHYCEN (ATMPN) 55 4.3.1
ABHAENGIGKEIT VON LICHTDOSIS UND LOESUNGSVERMITTLUNG 55
4.3.2 VERGLEICH DER ZELLINIEN 56
4.4 2,4-DI-(A-METHOXYETHYL)-DEUTEROPORPHYRIN LX (DIMEGIN) 57 4.5
5-AMINOLAEVULINSAEURE (ALA) 58
5 AUSWIRKUNG DER PDT AUF MEMBRANINTEGRITAET UND PROLIFERATION 59 5.1
MEMBRANINTEGRITAET NACH PDT 59
IMAGE 4
I N H A LT
5.2 WACHSTUMSVERHALTEN NACH PDT 61
6 MORPHOLOGISCHE VERAENDERUNGEN NACH PDT 64
6.1 AUSWIRKUNGEN AUF KOMPONENTEN DES ZYTOSKELETTS 64
6.2 ULTRASTRUKTURELLE VERAENDERUNGEN 67
6.2.1 INDOCYANINGRUEN (ICG) 67
6.2.2 9-ACETOXY-2,7,12,17-TETRAKIS-(SS-METHOXYETHYL)-PORPHYCEN (ATMPN) 67
7 PORPHYRIN-PLATIN-KOMPLEXEK2UNDK12 74
7.1 SPEKTROMETRISCHE EIGENSCHAFTEN 74
7.2 UNTERSUCHUNG DER PDT-WIRKUNG DER KOMPLEXE MITTELS MTT-TEST 74 7.2.1
KOMBINATIONSBEHANDLUNG MIT PORPHYRIN-PDT UND CISPLATIN 74 7.2.2 PDT MIT
PORPHYRIN-PLATIN-KOMPLEXEN K2 UND K12 75
8 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE 78
8.1 INDOCYANINGRUEN (ICG) 78
8.2 9-ACETOXY-2,7,12,17-TETRAKIS-(SS-METHOXYETHYL)-PORPHYCEN (ATMPN) 79
8.3 2,4-DI-(A-METHOXYETHYL)-DEUTEROPORPHYRIN LX (DIMEGIN) 79 8.4
5-AMINOLAEVULINSAEURE (ALA) 80
8.5 PORPHYRIN-PLATIN-KOMPLEXE K2 UND K12 80
IV D I S K U S S I ON 81^
1 DISKUSSION DER METHODIK 81
1.1 /-VJFRO-MODELL 81
1.2 BESTIMMUNG DER ZELLULAEREN AUFNAHME 81
1.2.1 PHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER ICG-AUFHAHME 81
1.2.2 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER ZELLULAEREN AUFNAHME 83 1.3
FLUORESZENZMIKROSKOPIE UND INTRAZELLULAERE LOKALISATION 83 1.4
LICHTQUELLEN 84
1.5 AUSTESTUNG DER PDT-WIRKUNG MITTELS MTT-TEST 84
1.6 UNTERSUCHUNG DER PDT-ZIELSTRUKTUREN 85
2 MOEGLICHE WIRKUNGSMECHANISMEN DER VERWENDETEN SUBSTANZEN 86 2.1
INDOCYANINGRUEN (ICG) 86
2.1.1 ZELLULAERE ICG-AUFHAHME 86
2.1.2 REAKTIONSMECHANISMUS NACH PHOTOAKTIVIERUNG VON ICG,
ULTRASTRUKTURELLE UNTERSUCHUNGEN 87
2.1.3 WIRKUNGSMECHANISMUS DER ICG-PHOTOTHERAPIE IN VITRO 88 2.2
9-ACETOXY-2,7,12,17-TETRAKIS-(SS-METHOXYETHYL)-PORPHYCEN (ATMPN) 88 2.2.1
ZELLULAERE ATMPN-AUFHAHME 89
2.2.2 INTRAZELLULAERE ATMPN-LOKALISATION 89
2.2.3 ULTRASTRUKTURELLE VERAENDERUNGEN NACH ATMPN-PDT 90 2.2.4
ZELLTYPSPEZIFISCHE UNTERSCHIEDE BEI ATMPN-AUFHAHME UND PDT-WIRKUNG 91
2.2.5 WIRKUNGSMECHANISMUS DER ATMPN-PDT IN VITRO 91
2.3 2,4-DI-(A-METHOXYETHYL)-DEUTEROPORPHYRIN LX (DIMEGIN) 91 2.3.1
ZELLULAERE DIMEGIN-AUFHAHME UND LOKALISATION 91
I N H A LT
2.3.2 ZELLTYPSPEZIFISCHE UNTERSCHIEDE BEI DIMEGIN-AUFHAHME UND
PDT-WIRKUNG 92
2.3.3 SUBZELLULAERE ZIELSTRUKTUREN DER DIMEGIN-PDT 92
2.4 5-AMINOLAEVULINSAEURE (ALA) 93
2.4.1 INTRAZELLULAERE PPLX-LOKALISATION 93
2.4.2 SUBZELLULAERE ZIELSTRUKTUREN DER ALA-PDT 94
2.4.3 ZELLTYPSPEZIFISCHE UNTERSCHIEDE BEI PPLX-FLUORESZENZ UND
PDT-WIRKUNG 94
3 AUSBLICK 96
V ZUSAMMENFASSUNG
VI LITERATURVERZEICHNIS
VII ANHANG
99
101
115
1 EIGENSCHAFTEN DER ZELLINIEN: ZELLGROESSE UND WACHSTUMSVERHALTEN 2
ABKUERZUNGEN 3 BEZUGSQUELLENNACHWEIS 4 DANKSAGUNG
115 116 117 119
- V -
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