Regulation des Gens für das atriale natriuretische Peptid der Ratte nach akuter Erhöhung der linksventrikulären Wandspannung:
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG
_
1. MYOKARDHYPERTROPHIE
1.1. MORPHOLOGISCHE VERAENDERUNGEN BEI MYOKARDHYPERTROPHIE
1.2. MOLEKULARE VERAENDERUNGEN BEI MYOKARDHYPERTROPHIE
2. WALL STRESS
3. PROTOONKOGENE
4. ATRIALES NATRIURETISCHES PEPTID (ANP)
5. ZIELSETZUNG
II. MATERIAL UND METHODEN
_ U
1. BAKTERIEN, PLASMIDE, ENZYME UND CHEMIKALIEN
U
2.
LOESUNGEN UND PUFFER 14
2.1. MEDIEN ZUR BAKTERIENANZUCHT J
1
3. VERSUCHSTIERE
18
3.1. ANAESTHESIE UND THORAKTOMIE !
8
3.2. ENTNAHME DER HERZEN !
G
4.
EX VIVO MODELL DES SCHLAGENDEN HERZENS IM LANGENDORFF-APPARAT 19
4.1. LANGENDORFF-APPARAT
19
4.2. VERSUCHSPROTOKOLLE ,O
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
4.2.1. ZEITVERLAUF ZUR VERAENDERTEN GENEXPRESSION 19
4.2.2. STIMULATION NACH IN VIVO DNA INJEKTION 20
4.2.3. STIMULATION ZUR GEWINNUNG NUKLEAERER EXTRAKTE 20
5. METHODEN ZUR DNA UNTERSUCHUNG 20
5.1. BAKTERIENANZUCHT 20
5.2. PRAEPARATION VON DNA 20
5.3. BESTIMMUNG DER DNA KONZENTRATION 21
5.4. SYNTHESE VON OLIGONUKLEOTIDEN 22
5.5. POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR) 22
5.6. RESTRIKTIONSSPALTUNG VON DNA 22
5 .7. DNA GELELEKTROPHORESE 23
5.8. DNA-FRAGMENT AUFREINIGUNG 23
5.8.1. DNA-FRAGMENT AUFREINIGUNG NACH GELELEKTROPHORESE 23
5.8.2. DNA-FRAGMENT AUFREINIGUNG NACH PCR ODER ENZYMBEHANDLUNG 24
5.9. DNA-KLONIERUNGSTECHNIKEN 24
5.9.2. DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN MIT ALKALISCHER PHOSPHATASE
24
5.9.3. LIGIEREN VON DNA-FRAGMENTEN 24
5.9.4. TRANSFORMATION
24
5.10. EINFUEGEN EINER SEQUENZSPEZIFISCHE MUTATION DM VITRO 25
5.11. DNA SEQUENZIERUNG 26
6. METHODEN ZUR RNA UNTERSUCHUNG 26
6.1. EXTRAKTION VON GESAMT RNA AUS HERZEN 26
6.2. BESTIMMUNG DER RNA KONZENTRATION 27
6.3. RNA GELELEKTROPHORESE
22
6.4. NORTHERN BLOT
28
6.4.1. KAPILLARTRANSFER
28
6.4.2. BENUTZTE GENSONDEN
28
6.4.3. RADIOAKTIVMARKIERUNG DER GENSONDEN (RANDOM PRIMED LABELING) 29
6.4.4. MEMBRAN HYBRIDISIERUNG
29
6.4.5. WASCHEN DER HYBRIDISIERTEN MEMBRAN
29
7. METHODEN ZUR PROTEIN UNTERSUCHUNG 30
7.1. GEWINNUNG VON GESAMTZELLPROTEIN EXTRAKTEN 30
II
INHALTSVERZEICHNIS
7.2. GEWINNUNG VON NUKLEAEREN PROTEINEN 30
7.3. BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 31
7.4. SDS POLYACRYLAMID GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 31
7.5. WESTERN BLOT 32
7.5.1. PROTEINTRANSFER DURCH ELEKTROBLOTTING 32
7.5.2. BENUTZTE ANTIKOERPER 32
7.5.3. DETEKTION 32
8. PROMOTORANALYSE MIT HILFE VON REPORTERGENEN 33
8.1. IN VTVO INJEKTION VON DNA 33
8.2. REPORTERGEN SYSTEME 34
8.2.1. LUZIFERASE 34
8.2.2. SS-GALAKTOSIDASE 34
9. UNTERSUCHUNG DER DNA-PROTEIN WECHSELWIRKUNG 35
9.1. RADIOAKTIVMARKIERUNG DER OLIGONUKLEOTTDE 35
9.2. GELRETARDATIONSASSAY 36
9.2.1. BINDUNGSREAKTION 36
9.2.2. NATIVE POLYACRYLAMID GELELEKTROPHORESE 36
10. AUTORADIOGRAPHIE UND QUANTIFIZIERUNG 37
10.1. AUTORADIOGRAPHIE 37
10.2. LASERDENSITOMETRISCHE QUANTIFIZIERUNG 37
12. STATISTISCHE AUSWERTUNGEN 38
III. ERGEBNISSE
_39
1. ANP GENEXPRESSION 39
2. ZEITVERLAUF DER EXPRESSION DER PROTOONKOGENE
C-FOS UND C-JUN 43
2.1. NACHWEIS DER PROTEINE C-FOS UND C-JUN 44
III
INHALTSVERZEICHNIS
3. DIREKTE
IN VIVO DNA INJEKTION IN DAS SCHLAGENDE MYOKARD DER
RATTE 45
3.1. ETABLIERUNG 47
3.1.1. LIPOFEKTION 47
3.1.2. VARIATION DES DNA/LIPOSOMEN VERHAELTNISSES 49
3.1.3. KORRELATION ZWISCHEN LUZIFERASE UND SS-GALAKTOSIDASE AKTIVITAETEN
50
3.2. KLONIERUNG VERSCHIEDENER BEREICHE DES ANP PROMOTORS 51
3.2.1. VERKUERZTE ANP PROMOTORBEREICHE 51
3.2.2. DELETIERTE ANP PROMOTORBEREICHE 55
3.3. INJEKTION 57
3.4 SEQUENZSPEZIFISCHE MUTATION DER AP-1 UND/ODER DER CRE
BINDUNGSSTELLEN 59
3.4.1. EINLUGEN DER MUTATIONEN 59
3.4.2. INJEKTION 60
4. ELEKTROPHORESE MOBILITAETSANALYSE 62
4.1. GEREINIGTES AP-1 PROTEIN 62
4.2. NUKLEAERE PROTEINEXTRAKTE 64
4.2.1. KOMPETITION 64
4.2.2. SUPER SHIFT 68
IV. DISKUSSION
_71
1. GENEXPRESSION 71
2. DNA/PROTEIN WECHSELWIRKUNGEN 73
3. DIREKTE
IN VIVO INJEKTION VON DNA IN DAS SCHLAGENDE
MYOKARD DER RATTE 75
4. ANALYSE DES ANP PROMOTORS 77
4. ABSCHLIESSENDE BEMERKUNGEN 81
IV
INHALTSVERZEICHNIS
V. ZUSAMMENFASSUNG
84
VT. LITERATURVERZEICHNIS
86
VII. SEQUENZ DES ANP-PROMOTORS
99 |
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