Charakterisierung endogener Neurotrophin-induzierender Faktoren:
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| Language: | German |
| Published: |
1997
|
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INHALTSVAZEICHNIS
I
1.
ZUSAMMENFASSUNG
1
2.
EINLEITUNG
3
NEUROTROPHINE,
EINE
FAMILIE
NEUROTROPHER
FAKTOREN
3
NEUROTROPHINREZEPTOREN
4
DIE
TRK-FAMILIE
DER
NEUROTROPHINREZEPTOREN
4
DER
P75-NEUROTROPHINREZEPTOR
NERVEN
WACHSTUMSFAKTOR
UND
DIE
ENTWICKLUNG
DES
PERIPHEREN
5
NERVENSYSTEMS
6
DIE
ENTWICKLUNG
DES
TRIGEMINALGANGLIONS
8
NGF-SYNTHESE
IN
ZIELGEWEBE
WAEHREND
DER
ENTWICKLUNG
11
VERLETZUNG
VON
PERIPHEREN
NERVEN
12
DER
ISCHIASNERV
12
LAESION
DES
ISCHIASNERVS
13
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
16
3.1.
ANTIKOERPER
UND
WACHSTUMSFAKTOREN
16
3.1.1.
ANTIKOERPER
16
3.1.2.
WACHSTUMSFAKTOREN
16
3.2.
CHEMIKALIEN
UND
EINWEGMATERIAL
17
3.3.
ENZYME
19
3.4.
GERAETE
20
3.5.
MEDIEN
UND
PUFFER
21
3.6.
PLASMIDE
UND
RNA-SONDEN
22
3.6.1.
PLASMID
FUER
NGF
IN
SITU
HYBRIDISIERUNGEN
(NGFIS)
22
3.6.2.
PLASMID
FUER
NGF-NORTHEM
BLOTS
(SK-9-NGF)
23
3.6.3.
PLASMID
FUER
GAPDH-NORTHEM
BLOT
23
3.6.4.
PLASMID
FUER
BDNF-NORTHEM
BLOTS
23
3.7.
TIERE
23
3.7.1.
WISTAR
RATTEN
23
3.7.2.
MAEUSE
23
3.7.2.1.
P75
KNOCK
OUT
MAEUSE
23
3.8.
ZELLEN
24
3.9.
KLONIERUNGSARBEITEN
24
3.9.1.
ANZUCHT
VON
E.COLI
ZUR
PLASMID-DNA-ISOLATION
24
3.9.1.1.
VORKULTUR
24
3.9.1.2.
HAUPTKULTUR
24
3.9.2.
GEWINNUNG
DER
PLASMID-DNA
AUS
E.COLI
24
3.9.3.
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
DNA
24
INHALTSVERZEICHNIS
H
3.9.4.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
DNA-MOLEKUELEN
25
3.9.5.
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
25
3.10.
ZELLKULTUR
25
3.10.1.
ERSTELLUNG
EINER
KULTUR
VON
FIBROBLASTEN
25
3
10.2.
KULTUR
VON
FIBROBLASTEN
26
3.103.
ZELLZAHLBESTIMMUNG
26
3.10.4.
EINFRIEREN
VON
ZELLEN
26
3.10.5.
REVITALISIEREN
26
3.10.6.
PRIMAERE
SCHWANNZELLKULTUR
27
3.11.
GEWEBE
27
3.11.1.
ENTNAHME
VON
ISCHIASNERVEN
27
3.11.2.
KULTIVIERUNG
DER
ISCHIASNERVEN
27
3.11.3.
GEWINNUNG
DES
KONDITIONIERTEN
MEDIUMS
28
3.11.4.
KRYOSCHNITTE
DER
ISCHIASNERVEN
28
3.11.5.
PRAEPARATION
UND
KULTIVIERUNG
DER
AORTEN
28
3.12.
NEUROTROPHIN-INDUKTION
29
3.12.1.
STIMULATION
DER
FIBROBLASTEN
29
3
12.2.
STIMULATION
DER
RATTENSCHWANNZELLEN
29
3.12.3.
STIMULATION
DER
ISCHIASNERVEN
29
3.12.4.
STIMULATION
DER
AORTEN
30
3.13.
NORTHERN
BLOT
ANALYSE
30
3.13.1.
RNA-EXTRAKTION
VON
ZELLEN
30
3.13.2.
RNA-EXTRAKTION
VON
GEWEBEN
31
3.13.3.
DNA
UND
RNA-KONZENTRATIONSBESTUENMUNG
31
3.13.4.
RNA-GLYOXYLIERUNG
32
3.13.5.
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
32
3.13.6.
VACUUMTRANSFER
DER
RNA
33
3.13.7.
DETEKTION
SPEZIFISCHER
SEQUENZEN
33
3.13.7.1.
DETEKTION
DER
RNA
MITTELS
CHEMILUMINESZENZ
33
3.13.7.1.1.
HERSTELLEN
DER
DIGOXIGENIN-MARKIERTEN
SONDE
33
3.13.7.1.2
HYBRIDISIERUNG
34
3.13.7.1.3.
DETEKTION
35
3.13.7.1.4.
DENSITOMETRISCHE
AUSWERTUNG
36
3
13.7.2.
RADIOAKTIVE
DETEKTION
36
3.13.7.2.1.
HERSTELLUNG
DER
RADIOAKTIV-MARKIERTEN
SONDE
36
3.13
7.2.2.
ABTRENNUNG
DER
FREIEN
NUKLEOTIDE
UEBER
EINE
SPINCOLUMN
37
3.13.7.2.3.
HYBRIDISIERUNG
DER
TRANSFERIERTEN
NUKLEINSAEUREN
37
3.13
8.
METHYLEN
BLAU
FAERBUNG
38
3.13.9.
ENTFERNEN
DER
SONDE
VON
NORTHERN
BLOTS
38
3.13.10.
GEWINNUNG
VON
POLY
A
'
RNA
39
3.13.11.
EINSETZEN
DER
RNA-STANDARDS
40
3.14.
NICHT-RADIOAKTIVE
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
40
3
14
1.
BESCHICHTUNG
VON
OBJEKTTRAEGERN
40
3.14.2.
HERSTELLUNG
DER
SONDE
40
INHALTSVERZEICHNIS
M
3.14.3.
VORBEHANDLUNG
DER
SCHNITTE
40
3.14.4.
HYBRIDISIERUNG
41
3.14.5.
DETEKTION
42
3.15.
PROTEINCHEMIE
43
3.15.1.
HOMOGENISIEREN
DER
SCHWEINEHERZEN
43
3.15.2.
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
44
3.15.3.
CHROMATOGRAPHIE
44
3.15.3.1.
BUTYLSEPHAROSESAEULE
44
3.15.3.2.
HEPARINSEPHAROSE
CL-6B
45
3.15.3.3.
SUPERDEX
75
(GEIFILTRATION)
45
3.15.4.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
46
3.15.5.
ULTRAFILTRATION
46
3.15.5
1.
EINENGEN
UEBER
CENTRICON
47
3.15.5.2.
ULTRAFILTRATION
UEBER
CENTRIPLUS
47
3.16.
IMMUNOCHEMIE
47
3.16.1.
TCA-FAELLUNG
47
3
16.2.
SDS-PAGE
47
3.16.3.
WESTERN
BLOT
49
3.16.3.1.
PONCEAU
S
FAERBUNG
49
3.16.3.2.
WESTERN
BLOT
DETEKTION
49
3.16.3.3.
WESTERN
BLOT
STRIPING
50
3.16.4.
GELFAERBUNGEN
51
3.16.4.1.
COOMASSIEFAERBUNG
51
3.16.4.2.
SILBERFARBUNG
51
3.16.5.
IMMUNPRAEZIPITATION
52
3.16.6.
INTERTEST-ISS
(MAUS
INTERLEUKIN-LSS
ELISA
KIT)
53
3.17.
IMMUNOHISTOCHEMIE
53
3.17
1.
NACHWEIS
ABUNDANTER
PROTEINE
54
3.17.2.
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
MIT
VECTASTAIN
54
4.
ERGEBNISSE
55
4.1.
REGULATION
DER
NGF
MRNA
EXPRESSION
WAEHREND
DER
ENTWICKLUNG
55
4.1.1.
INDUKTION
DER
NGF
MRNA
IN
PRIMAEREN
FIBROBLASTENKULTUREN
DURCH
SCHWEINEHERZHOMOGENAT
UND
DEFINIERTE
WACHSTUMSFAKTOREN
55
4.1.2.
DIE
NGF
MRNA-INDUZIERENDE
AKTIVITAET
IM
SCHWEINEHERZHOMOGENAT
IST
PROTEASE
UND
HITZEEMPFINDLICH
58
4.1.3.
AUFREINIGUNG
DER
NGF
MRNA-INDUZIERENDEN
AKTIVITAET
AUS
SCHWEINE
HERZHOMOGENAT
60
4.1.4.
EINFLUSS
VON
PROTEINKINASEINHIBITOREN
AUF
DIE
NGF
MRNA-INDUZIERENDE
AKTIVITAET
62
4.1.5.
CHARAKTERISIERUNG
DER
AKTIVITAET
MIT
HILFE
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
BEKANNTE
WACHSTUMSFAKTOREN
65
4.1.6.
UNTERSUCHUNG
DER
NGF
MRNA-INDUKTION
DURCH
AFGF
UND
BFGF
IN
KULTIVIERTEN
AORTENFRAGMENTEN
72
INHALTSVERZEICHNIS
IV
4.2.
REGULATION
DER
EXPRESSION
DER
NEUROTROPHINE
NACH
NERVLAESION
75
4,2.1.
INDUKTION
DER
NGF
MRNA
IN
KULTIVIERTEN
MAUSISCHIASNERVEN
DURCH
KONDITIONIERTES
MEDIUM
75
4.2.2.
DIE
NGF
MRNA-INDUKTION
DES
KONDITIONIERTEN
MEDIUMS
IST
HITZE-
UND
PROTEASESENSITIV
77
4.2.3.
II
1
-ANTIKOERPER
KOENNEN
DIE
AKTIVITAET
DES
KONDITIONIERTEN
MEDIUMS
NICHT
REDUZIEREN
78
4.2.4.
KANDIDATEN
SUCHE
81
4.2.5.
DER
P75-NEUROTROPHINREZEPTOR
IST
NICHT
ERFORDERLICH
FUER
DIE
NGF
MRNA-INDUKTION
DURCH
DAS
KONDITIONIERTE
MEDIUM
84
4.2.6.
CHARAKTERISIERUNG
DES
KONDITIONIERTEN
MEDIUMS
85
4.2.7.
BDNF
MRNA
IN
KULTIVIERTEN
ISCHIASNERVEN
87
4.2.8.
ZELLULAERE
LOKALISATION
DER
NGF
MRNA-EXPRESSION
88
4.2.8.1.
NGF
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
88
4.2.8.2.
MAKROPHAGEN
SIND
NICHT
VERANTWORTLICH
FUER
DIE
NGF
MRNA-EX-
PRESSION
89
4.2.8.3.
EINE
SUBPOPULATION
VON
SCHWANNZELLEN
-
ZUSTAENDIG
FUER
DIE
EXPRESSION
DER
NGF
MRNA?
91
5.
DISKUSSION
93
5.1.
REGULATION
DER
NGF
MRNA
EXPRESSION
WAEHREND
DER
ENTWICKLUNG
93
5.1.1.
QUELLE
FUER
DIE
NGF
MRNA-INDUZIERENDE
AKTIVITAET
93
5.1.2.
NACHWEIS
DER
NGF
MRNA-INDUKTION
94
5.1.3.
AUFREINIGUNG
DER
AKTIVITAET
95
5.1.4.
CHARAKTERISIERUNG
DER
AKTIVITAET
95
5.1.4.1
EINFLUSS
VON
PROTEINKINASEINHIBITOREN
96
5.1.5.
NGF
MRNA-INDUKTION
DURCH
MITGLIEDER
BEKANNTER
FAMILIEN
VON
WACHSTUMSFAKTOREN
UND
DER
EINFLUSS
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
BEKANNTE
WACHSTUMSFAKTOREN
AUF
DIE
AKTIVITAET
98
5.1.5.1.
EINFLUSS
EINES
TGFSS-ANTIKOERPERS
98
5.1.5.2.
EINFLUSS
VON
BFGF-ANTIKOERPEM
100
5.1.6.
AORTEN
ALS
SPEZIFISCHERES
IN
VITRO
TESTSYSTEM
101
5.1.7.
WEITERES
VORGEHEN
102
5.2.
REGULATION
DER
EXPRESSION
DER
NEUROTROPHINE
NACH
VERLETZUNG
103
5.2.1.
DAS
KONDITIONIERTE
MEDIUM
103
5.2.2.
II
1
UND
DIE
AKTIVITAET
DES
KONDITIONIERTEN
MEDIUMS
105
5.2.3.
DIE
AKTIVITAET
-
EIN
BEKANNTER
WACHSTUMSFAKTOR?
108
5.2.4.
DER
P75-NEUROTROPHINREZEPTOR
IST
NICHT
ESSENTIELL
FUER
DIE
NGF
MRNA-INDUKTION
DURCH
DAS
KONDITIONIERTE
MEDIUM
109
5.2.5.
HEPARINSAEULE
109
5.2.6.
WEITERES
VORGEHEN
111
5.2.7.
ORT
DER
NGF
MRNA-EXPRESSION
111
5.2.7
1.
ZELLTYPEN
DES
ISCHIASNERVS
113
5.2.7
1.1.
MAKROPHAGEN
113
5.2.7.1.2.
SCHWANNZELLEN
113
5.2.7.1.3.
MASTZELLEN
114
INHALTSVERZEICHNIS
V
5.2.7.1.4.
FIBROBLASTEN
UND
ENDOTHELZELLEN
115
5.2.8.
ROLLE DER
NGF
MRNA-INDUZIERENDEN
AKTIVITAET
115
5.2.9.
BDNF
MRNA-ANSTIEG
116
5.2.10.
WEITERES
VORGEHEN
118
6.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
119
7.
LITERATURVERZEICHNIS
122 |
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| author | Dethleffsen, Kathrin 1962- |
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