mRNA-Analyse und Sequenzierung von Biosynthesegenen für das Lantibiotikum Pep5:
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| Format: | Microfilm Book |
| Language: | German |
| Published: |
1997
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| Edition: | [Mikrofiche-Ausg.] |
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| Item Description: | Erscheinungsjahr auf der Haupttitels.: 1996. - Bonn, Univ., Diss., 1997 (Nicht für den Austausch). - Mikrofiche-Ausg. : 2 Mikrofiches : 24x |
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1. EINLEITUNG.1
2. MATERIAL UND METHODEN.15
2.1 BAKTERIENSTAEMME UND PLASMIDE.15
2.2 KULTURBEDINGUNGEN.15
2.3 MEDIEN.15
2.4 TEST AUF PEP5-PRODUKTION.\.16
2.5 DNA- UND RNA-PRAEPARATIONEN.17
2.5.1 PLASMIDPRAEPARATION AUS
E. COLI NACH BIRNBOIM & DOLY.17
2.5.2 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS
E. COLI NACH HOLMES & QUIGLEY.17
2.5.3 PLASMIDPRAEPARATION AUS
E. COLI UEBER ISOPYKNISCHE ZENTRIFUGATION IN EINEM.17
CAESIUMCHIORID-ETHIDIUMBROMID-DICHTEGRADIENTEN
2.5.3.1 AUFREINIGUNG VON PLASMID-DNA DURCH ULTRAFILTRATION IN.18
CENTRICON-100 UND CENTRICON-30 MIKROKONZENTRATOREN
2.5.4 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS .
COLI MIT QUIAGEN-20 SAEULEN.18
2.5.5 RNA-PRAEPARATION NACH SHIMOTSU ET
AL.19
2.5.6 RNA-PRAEPARATION NACH LEE & BIRKBECK.20
2.5.7 RNA-MINIPRAEPARATION NACH OSKOUIAN & STEWART.20
2.5.8 RNA-PRAEPARATION DURCH ZELLAUFSCHLUSS MITTELS NISIN.21
2.6 RESTRIKTIONSENZYMVERDAU.21
2.7 CHARAKTERISIERUNG UND HERKUNFT DER VERWENDETEN VEKTOR-DNA.22
2.7.1 PBR322. 22
2.7.2 PUC19.22
2.7.3 PCU1.23
2.7.4 PCM1.23
2.8 AGANOSEGELELEKTROPHORESE VON DNA.23
2.9 AGAROSEGELELEKTROPHORESE VON RNA.24
2.10 TRANSFER VON DNA UND RNA: SOUTHERN BZW. NORTHERN BLOT.26
2.11 ELUTION VON DNA AUS AGAROSEGELEN.26
2.11.1 ELEKTROELUTION VON DNA AUS AGAROSEGELEN.27
2.11.2 ELUTION VON DNA AUS AGAROSEGELEN DURCH ZENTRIFUGATION.27
2.12 SPEKTROPHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER DNA- BZW.27
RNA-KONZENTRATION UND REINHEIT
2.13 OLIGONUKLEOTIDSYNTHESE.28
2.13.1 OLIGONUKLEOTID-REINIGUNG.28
2.13.1.1 REINIGUNG DER SYNTHETISCHEN OLIGONUKLEOTIDE MITTELS HPLC.28
2.13.1.2 REINIGUNG DER OLIGONUKLEOTIDE MITTELS OPC-SAEULEN.29
2.14 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR).29
2.14.1 PRAEPARATION VON PCR-PRODUKTEN FUER DIE SEQUENZIERUNG.31
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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.
14.2
2.15
2
.
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2
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15
.
1.1
2
.
15
.
1.2
2.16
2
.
16.1
2
.
16.2
2
.
16.3
2.17
2.18
2.19
2.20
2.21
2
.
21.1
2
.
21.2
2
.
21.3
2
.
21.4
2
.
21.5
2.22
SEITE
KONTROLLE UND AUFREINIGUNG DER PCR-PRODUKTE FUER DIE SEQUENZIERUNG.32
HERSTELLUNG SEQUENZSPEZIFISCHER DNA-SONDEN.32
RADIOAKTIVE SONDEN.
RADIOAKTIVE 5'-ENDMARKIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN (Z.B. DURCH Y
32
P-DATP).32
MITTELS POLYNUKLEOTIDKINASE.
EINBAU RADIOAKTIVER NUKLEOTIDE IN DNA MITTELS "RANDOM PRIMER EXTENSION"
(RPE).33
HYBRIDISIERUNG VON MARKIERTEN DNA-SONDEN MIT MEMBRANFIXIEITER
NUKLEINSAEURE.34
HYBRIDISIERUNG VON SOUTHERN BLOTS MIT 32
P-5'-ENDMARKIERTEN OLIGONUKLEOTIDEN.
34
HYBRIDISIERUNG VON "RPE"-DNA-SONDEN.35
DIGOXIGENIN-MARKIERUNG.
BESTIMMUNG DER CHEMISCHEN HALBWERTZEIT VON MESSENGER RNA (MRNA).38
PRIMERVERTAENGERUNGS-ASSAY ZUR BESTIMMUNG DER
TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTE.39
SEQUENZIERUNG: EINLEITENDE UEBERLEGUNGEN.
40
ERZEUGUNG VON DELETIONSKLONEN MITTELS EXONUKLEASE III (EXO
ILL)-VERDAU.40
DNA-SEQUENZIERUNG.
SEQUENZIERUNG DOPPELSTRAENGIGER PLASMID-DNA MITTELS T7-DNA-POLYMERASE.46
EINZELSTRANGSEQUENZIERUNG VON BIOTINYLIERTEN PCR-PRODUKTEN MITTELS.47
DYNABEADS-M280 (FESTPHASENSEQUENZIERUNG)
DOPPELSTRANGSEQUENZIERUNG VON PCR-PRODUKTEN MITTELS "CYCLE SEQUENCING".
49
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (PAGE).
51
SEQUENZIERUNG MIT DEM AUTOMATIC LASER FLUORESCENCE (ALF)-SEQUENCER.52
CHEMIKALIENNACHWEIS.
M
3. ERGEBNISSE.
3.1 ISOLIERUNG VON RNA AUS S.
EPIDERMIDIS 5.
54
3.2 PRAEPARATION SEQUENZSPEZIFISCHER SONDEN.
57
3.3 RNA-AGAROSEGELELEKTROPHORESE.61
3.4 ANFERTIGUNG VON NORHTEM BLOTS.62
3.5 CHARAKTERISIERUNG SPEZIFISCHER MRNAS.63
3.5.1 DOT BLOTS.63
3.5.2 BESTIMMUNG DER RELATIVEN TRANSKRIPTMENGEN.
66
3.5.3 BESTIMMUNG DER TRANSKRIPTGROESSEN SPEZIFISCHER MRNAS.
66
3.5.3.1 DETEKTION MIT DER PEPA-SPEZIFISCHEN SONDE.
68
3.5.3.2. DETEKTION MIT DER PEPF-SPEZIFISCHEN SONDE.69
3.5.4 BESTIMMUNG DER CHEMISCHEN HALBWERTZEITEN DER
PEPL- UND DER PEPA-MRNA.70
3.5.5 BESTIMMUNG DER 5'-TERMINI.
72
3.6 KORRELATION DER WACHSTUMSPHASE MIT DEM PEPA-MRNA-GEHALT.
75
UND IM MEDIUM DETEKTIERBAREM PEP5
3.7 ERZEUGUNG EINER DELETIONSKLONBIBLIOTHEK VON PCM1.
77
SEITE
3.7.1 BESTIMMUNG DER ORIENTIERUNG DES 5 KBP-M/NDLLL-FRAGMENTS INNERHALB
VON PCM1.77
3.7.2 LINEARISIERUNG VON PCM
1
MITTELS RESTRIKTIONSENZYMVERDAU.
79
3.7.3 EXONUKLEASE ILL-DELETIONSREAKTIONEN.
79
3.7.4 TRANSFORMATION UND SCREENING DER DELETIONSFRAGMENTE.80
3.7.5 DETEKTION GEEIGNETER TRANSFORMANTEN.82
3.7.6 PRAEPARATION DER DELETIONSKLONE ZUR SEQUENZIERUNG.82
3.7.6.1 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA ZUR SEQUENZIERUNG UEBER QUIAGEN
20-SAEULEN. 83
3.7.6.2 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA ZUR SEQUENZIERUNG UEBER EINEN.83
CAESIUMCHLORID-ETHIDIUMBROMID-DICHTEGRADIENTEN
3.7.6.3 PRAEPARATION DER PCR-PRODUKTE DER DELETIONSKLONPLASMIDE PJS1 BIS
PJS14.84
3.8 SEQUENZIERUNG.84
3.8.1 SYNTHESE DER ALS PRIMER EINGESETZTEN OLIGONUKLEOTIDE.84
3.8.2 SEQUENZIERUNG MIT DICKEGRADIENTENGELEN ("WEDGE-SHAPE"-GELEN).85
3.8.3 SEQUENZIERUNG MIT GELEN AUS DERIVATISIERTEM ACRYLAMID.85
3.9 SEQUENZIERUNG DES 5,0 KBP WINDLM-FRAGMENTS VON PED503.
86
3.9.1 SEQUENZIERUNG VON PLASMID-DNA MIT T7-DNA-POLYMERASE.87
(ISOTHERME DOPPELSTRANGSEQUENZIERUNG)
3.9.2 SEQUENZIERUNG VON BIOTINYLERTEN PCR-PRODUKTEN MITTELS
DYNABEADS-M280.87
(EINZELSTRANGSEQUENZIERUNG)
3.9.3 CYCLE SEQUENDNG VON PCR-PRODUKTEN.
88
3.9.4 AUSWERTUNG DER SEQUENZDATEN.90
3.10 ISOLIERUNG UND NACHWEIS DER PEPT-MRNA.99
4. DISKUSSION.!.101
4.1 PROMOTORSTRUKTUREN.101
4.2 CHARAKTERISTIKA DER LANTIBIOTIKA-SRUKTURGEN- UND
-BIOSYNTHESEGEN-MRNAS.103
4.2.1 TRANSKRIPTGROESSEN UND PROMOTORSTRUKTUREN DER EPIDERMIN-, NISIN-
UND.103
SUBTILIN-OPERONS
4.2.2 TRANSKRIPTGROESSEN UND PROMOTORSTRUKTUREN DES PEP5-OPERONS.105
4.2.3 HALBWERTZEITEN VON MRNAS.109
4.2.3.1 ABBAUREAKTIONEN.109
4.2.3.2 HALBWERTZEITEN DER LANTIBIOTIKA-STRUKTURGEN- UND
BIOSYNTHESEGEN-MRNAS.112
4.3 SEQUENZIERUNG.115
5. ZUSAMMENFASSUNG.118
6
. LITERATURVERZEICHNIS.120 |
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| spelling | Süling, Jörg 1959- Verfasser (DE-588)115772170 aut mRNA-Analyse und Sequenzierung von Biosynthesegenen für das Lantibiotikum Pep5 vorgelegt von Jörg Süling [Mikrofiche-Ausg.] 1997 145 Bl. Ill., graph. Darst. txt rdacontent h rdamedia he rdacarrier Erscheinungsjahr auf der Haupttitels.: 1996. - Bonn, Univ., Diss., 1997 (Nicht für den Austausch). - Mikrofiche-Ausg. : 2 Mikrofiches : 24x Sequenzanalyse Chemie (DE-588)4132277-0 gnd rswk-swf Gen (DE-588)4128987-0 gnd rswk-swf Lantibiotikum (DE-588)4305682-9 gnd rswk-swf Messenger-RNS (DE-588)4169499-5 gnd rswk-swf Staphylococcus epidermidis (DE-588)4318476-5 gnd rswk-swf Biosynthese (DE-588)4006902-3 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Staphylococcus epidermidis (DE-588)4318476-5 s Lantibiotikum (DE-588)4305682-9 s Biosynthese (DE-588)4006902-3 s Gen (DE-588)4128987-0 s Messenger-RNS (DE-588)4169499-5 s Sequenzanalyse Chemie (DE-588)4132277-0 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=007864543&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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