Physikalische Kartierung von Chromosom 20 mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH):
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1995
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1.
2.
2.1.
2.1.1.
2.1.2.
2.1.3.
2.1.4.
2.2.
2.2.1.
2.2.2.
2.2.3.
2.2.4.
2.2.4.1.
2.2.4.1.1.
2.2.4.1.2.
2.2.4.2.
2.2.4.3.
2.2.5.
2.2.5.1.
INHALTSVERZEICHNIS
EINLEITUNG
1
MATERIAL
&
METHODEN
13
MATERIAL
13
GEBRAUCHSWALEN
12
ALLGEMEINE
CHEMIKALIEN
12
GEBRAUCHSLOESUNGEN
15
ART
UND
HERKUNFT
DES
VERWENDETEN
UNTERSUCHUNGSMATERIALS
17
DNA-SONDEN
17
PROBANDEN
MIT
ALAGILLE
SYNDROM
17
METHODEN
19
ISOLIERUNG
VON
PLASMID
BZW.
COSMID-DNA
19
ISOLIERUNG
VON
YAC-DNA
AUS
LOW-MELTING
POINT-AGAROSE
21
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
21
HERSTELLUNG
DER
CHROMOSOMENPRAEPARATE
22
CHROMOSOMENPRAEPARATION
AUS
LYMPHOZYTEN
22
METAPHASEPRAEPARATION
22
PROMETAPHASEPRAEPARATION
23
CHROMOSOMENPRAEPARATION
AUS
EBV
TRANSFORMIERTEN
B-LYMPHOZYTEN
24
CHROMOSOMENPRAEPARATION
AUS
FIBROBLASTEN
25
HERSTELLUNG
VON
CHROMATINFILAMENTEN
AUS
FIBROBLASTEN
26
HALO-PRAEPARATION
26
2.2.5.2.
HERSTELLUNG
VON
FREIEN
CHROMATINFILAMENTEN
AUS
FIBROBLASTEN
28
2.2.6.
FLUORESZENZ
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
(FISH)
28
2.2.6.1.
VORBEHANDLUNG
DER
OBJEKTTRAEGER
28
2.2.6.2.
RNASE-BEHANDLUNG
DER
OBJEKTTRAEGER
29
2.2.6.3.
DENATURIERUNG
DER
OBJEKTTRAEGER
29
2.2.6.4.
MARKIERUNG
DER
DNA-SONDEN
MITTELS
NICKTRANSLATION
30
2.2.6.4.1.
BIOTINYLIERUNG
BZW.
DIGOXIGENIERUNG
DER
SONDEN
30
2.2.6.4.2.
KONTROLLE
DES
BIOTIN-EINBAUS
MITTELS
DOT-BLOT
31
2.2.6.5.
ZUSATZ
VON
KOMPETITIONS-DNA
32
2.2.6.6.
HYBRIDISIERUNGSANSATZ
UND
PREANNEALING
32
2.2.6.7.
WASCHEN
NACH
DER
HYBRIDISIERUNG
33
2.2.6.8.
DETEKTION
UND
AMPLIFIKATION
DER
HYBRIDISIERUNGSSIGNALE
34
2.2.6.9.
EINFARBIGE
FISH:
AVIDIN-FITC-DETEKTION
35
2.2.6.9.1.
FAERBUNG
UND
KONSERVIERUNG
35
2.2.6.10.
ZWEIFARBIGE
FISH:
AVIDIN-FTTC
UND
DIGOXIGENIN-CY3-DETEKTION
36
2.2.6.11.
AUSWERTUNG
37
3.
ERGEBNISSE
38
3.1.
PHYSIKALISCHE
KARTIERUNG
VON
CHROMOSOM
20
MITTELS
FLUORESZENZ
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
(FISH)
38
3.1.1.
AUSWERTUNG
DER
FISH-LOKALISIERUNGEN
38
3.1.2.
KARTIERUNG
VON
CHROMOSOM
20-SPEZIFISCHEN
LOCI
39
3.1.2.1.
LOKALISIERUNG
VON
CHROMOSOM
20-SPEZIFISCHEN
GENSONDEN
39
3.1.3.
LOKALISIERUNG
VON
CHROMOSOM
20-SPEZIFISCHEN
ANONYMEN
DNA-SONDEN
49
3.1.4.
ERSTELLUNG
EINER
PHYSIKALISCHEN
KARTE
FUER
CHROMOSOM
20
AUFGRUND
DER
FISH-ERGEBNISSE
50
3.2.
PHYSIKALISCHE
KARTIERUNG
VON
44
YACS
DER
FUER
DAS
ALAGILLE
SYNDROM
KRITISCHEN
CHROMOSOMEN
REGION
(AGSCR)
20PL
1.23-PL2.1
52
3.3.
EXEMPLARISCHE
UEBERPRUEFUNG
DER
LINEAREN
ANORDNUNG
EINIGER
YACS
UEBER
2-FARBIGE
FISH
55
3.4.
PHYSIKALISCHE
KARTIERUNG
VON
COSMIDEN
INNERHALB
EINES
CONTIGS
FUER
YAC
350E8
UND
16H3
58
3.4.1.
ETABLIERUNG
DER
METHODE
58
3.4.2.
DOPPELHYBRIDISIERUNG
MIT
1
YAC
UND
1
COSMID
61
3.4.3.
DOPPELHYBRIDISIERUNG
MIT
2
COSMIDEN
62
3.3.4.
SIMULTANE
HYBRIDISIERUNG
VON
3
COSMIDEN
64
3.5.
DELETIONSANALYSEN
AN
AGS-PROBANDEN
MITTELS
FISH
64
3.5.1.
BEI
7
AGS-PROBANDEN
MIT
EINER
CYTOGENETISCH
SICHTBAREN
STRUKTURVERAENDERUNG
20P
65
3.5.2.
DELETIONSANALYSEN
BEI
AGS-PROBANDEN
MIT
CYTOGENETISCH
UNAUFFAELLIGEM
ODER
BISHER
NICHT
ANALYSIERTEM
KARYOTYP
71
4.
DISKUSSION
74
4.1.
PHYSIKALISCHE
KARTE
DES
MENSCHLICHEN
CHROMOSOMS
20
74
4.2.
PHYSIKALISCHE
KARTIERUNG
VON
44
YACS
DER
FUER
DAS
ALAGILLE
SYNDROM
KRITISCHEN
REGION
(AGSCR)
20PL
1.23-PL2.1
88
4.3.
ERSTELLUNG
EINES
COSMID-CONTIGS
VON
YAC
16H3
UND
350E8
93
4.4.
CHARAKTERISIERUNG
DER
FUER
DAS
ALAGILLE
SYNDROM
KRITISCHEN
CHROMOSOMENREGION
(AGSCR)
DURCH
DELETIONSANALYSEN
AN
AGS-PROBANDEN
MITTELS
FISH
96
4.5.
AUSBLICK
99
5.
ZUSAMMENFASSUNG
100
6.
LITERATUR
102 |
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