Molekularbiologische und immunbiochemische Untersuchungen zur Komplementresistenz humaner Melanomzellen:
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
.
.
.
-
.
5
1.
EINLEITUNG
.
7
LI.
DAS
KOMPLEMENTSYSTEM
UND
SEINE
KONTROLLPROTEINE
-.
7
12.
DIE
MELANOMZELLINIEN
SK-MEL-170
UND
SK-MEL-93-2
_
11
13.
AUFGABENSTELLUNG
.
14
2.
MATERIAL
.
15
2.1
CHEMIKALIEN
.
.
.
YY
.
15
2.2
ANTISEREN
UND
ANTIKOERPERLOESUNGEN
.
.
.
15
2.3
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
16
2.4.
VERBRAUCHSARTIKEL
UND
GERAETE
.
27
3.
METHODEN
.
28
3.1.
ZELLKULTUR
.
28
3.1.1.
DAUERKULTUR
.
28
3.1.2.
EINFRIEREN,
AUFTAUEN
UND
LAGERUNG
VON
ZELLEN
.
28
3.1.3.
BESTIMMUNG
DER
ZEITZAHL
.
29
3.1.4.
UNTERSUCHUNG
DER
ZELLKULTUREN
AUF
MYCOPLASMENKONTAMINATION
_
29
3.2.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
METHODEN
.
30
3.2.1.
ANTIKOERPERBINDUNGSASSAY
.
.
.
30
3.2.2.
MARKIERUNG
TOTER
ZELLEN
MIT
PROPIDIUMIODID
.
31
33.
PROTEINBIOCHEMISCHE
UND
IMMUNBIOCHEMISCHE
METHODEN
.
32
3.3.1.
GEWINNUNG
VON
MEMBRANEXTRAKTEN
.
.
.
32
3.3.2.
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE).
32
3.3.3.
PROTEINFAERBUNG
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
MIT
COOMASSIE-BRILLIANT-BLAU
.
33
3.3.4.
SILBEMITRATFAERBUNG
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
.
34
3.3.5.
TROCKNUNG
VON
GELEN
.
34
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.6.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
PROTEINEN
MIT
L25
1
.
34
3.3.7.
ULTRAFILTRATION
VON
PROTCINLOESUNGCN
.
35
3.3.8.
DOPPELDIFFUSIONSTEST
NACH
OUCHTERLONY
. .
35
3.3.9.
ISOLIERUNG
VON
KOMPLEMENT
C3
AUS
HUMANEM
BLUTPLASMA
.
35
3.3.10.
FLUESSIGPHASC-ASSAY
FUER
DIE
C3-SPALTENDC
AKTIVITAET
VON
MEMHRANEX
TRAKTEN
.
36
3.3.11.
IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE
.
35
3.3.12.
ELEKTROPHORETISCHER
PROTEINTRANSFER
(WESTERN-BLOT)
.
38
3.3.13.
AMIDOSCHWARZFAERBUNG
VON
PROTEINEN
AUF
PVDF-MEMBRANEN
.
38
3.3.14.
IMMUNOPRINTING
VON
PROTEINEN
AUF
PVDF-MEMBRANEN
.
38
3.3.15.
KOMPLEMENT
ZYTOTOXIZITAETSTEST
.
39
3.3.16.
SEMIPRAEPARATIVE
F(AH')
3
-FRAGMCNL
DARSTELLUNG
.
40
3.3.17.
INHIBIERUNGSSTUDICN
ZUR
KOMPLCMCNTRESISTCNZ
.
40
3.4.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
41
3.4.1.
SPEKTROSKOPISCHE
BESTIMMUNG
VON
DNA
UND
RNA-KONZENTRA
TIONEN
.
.41
3.4.2.
EXTRAKTION
VON
DNA-LOESUNGEN
.
41
3.4.3.
SYNTHESE
VON
DNA-OLIGONUKLEOTID
PRIMERN
.
_42
3.4.4.
AMPLIFIKATION
VON
CDNA-FRAGMENTEN
(PCR)
.
.42
3.4.5.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.COLI
ZELLEN
.
43
3.4.6.
RNASE-DEKONTAMINATION
VON
PUFFERN,
LOESUNGEN.
GELASSEN
UND
GE
RAETEN
.
44
3.4.7.
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
MCLANOMZELLEN
.
44
3.4.8.
MRNA-ISOLIERUNG
AUS
GESAMT-RNA
.
45
3.4.9.
ERSTELLUNG
EINER
LAMBDA
ZAP
EXPRESS
GENBANK
.
46
3.4.10.
VORBEREITUNG
DERXLI-BLUE
MRF-ZELLEN
AUF
DIE
PHAGCNTRANSFOR
MATION
.
48
3.4.11.
PHAGENTITERBESTIMMUNG
.
_
.
49
3.4.12.
AMPLIFIKATION
DER
PRIMAER-GENBANK
.
49
3.4.13.
PHAGEN-PLAQUE
HYBRIDISIERUNG
.
50
3.4.14.
DIREKTE
MRNA-ISOLIERUNG
AUS
MCLANOMZELLEN
.
51
3.4.15.
CDNA-SYNTHESE
.
52
3.4.16.
NATIVE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORCSC
FUER
DNA
.
53
3.4.17.
AGAROSEGELELEKTROPHORE.SE
.
53
3.4.18.
FORMALDEHYD-AGAROSEGELCLEKTROPHORESE
.
53
3.4.19.
ALKALISCHE
AGAROSEGCLELEKTROPHORESE
.
54
3.4.20.
ETHIDHIMBROMIDFAERBUNG
VON
DNA
.
54
3.4.21.
EXTRAKTION
VON
DNA
AUS
AGAROSE-GELEN
.
55
3.4.22.
RESIRIKTIONSCNDONUKLEASEVCRDAU
VON
DNA-MOLEKUELEN
.
55
3.4.23.
SUBKLONIERUNG
VON
CDNA-FRAGMENTEN
.
56
3.4.24.
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.COLI-ZCLLEN
.
56
3.4.25.
MINI-PREP
VON
POSITIV
TRANSFORMIERTEN
E.COLI-ZCLLEN
.
57
INH
ALTSVERZEICHNIS
3.4.26.
MEDI-PREP
VON
POSITIV
TRANSFORMIERTEN
E.COLI-ZELLEN
_
57
3.4.27.
SEQUENZIERUNG
VON
SUBKLONIERTEN
CDNA-FRAGMENTEN
DURCH
CYCLE
SEQUENCING
.
58
3.4.28.
SEQUENZIERUNG
VON
SUBKLONIERTEN
CDNA-FRAGMENTEN
DURCH
T7
SEQUENZIERUNG
.
59
3.4.29.
ANALYSE
DER
SEQUENZIERUNGSREAKTIONEN
MIT
HILFE
DES
ALFEXPRESS
SEQUENZIERGERAETES
.
60
3.4.30.
TRANSFER
VON
RNA
AUF
NITROZELLULOSE-MEMBRANEN
(NORTHERN
BLOT)
------
60
3.4.31.
HYBRIDISIERUNG
VON
32
P-MARKIERTEN
DNA-SONDEN
MIT
IMMOBILI
SIERTER
MRNA
.
61
4.
ERGEBNISSE
.
.
.
63
4.1.
CHARAKTERISIERUNG
DES
EXPERIMENTELLEN
SYSTEMS
ZUR
KOMPLEMENTSENSITIVITAET
VON
MELANOMZELLEN
.
-
63
4.1.1.
KOMPLEMENTLYSE
VON
HUMANEN
MELANOMZELLEN
.
63
4.1.2.
DEGRADIERUNG
VON
KOMPLEMENT
C3
DURCH
MELANOMZELLEN
.
66
4.1.2.1.
REINDARSTELLUNG
VON
KOMPLEMENT
C3
.
66
4.1.2.2.
C3-DEGRADIERUNG
DURCH
MEMBRANEXTRAKTE
VON
SK-MEL-170
ZELLEN
.
71
4.2.
MEMBRANGEBUNDENE
KOMPLEMENT-REGULATIONSPROTEINE
AUF
HUMANEN
MELANOMZELLEN
.
73
4.2.1.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
ANTIKOERPER-BINDUNGSSTUDIEN
73
4.2.1.1
NACHWEIS
VON
MEMBRANGEBUNDENEN
FAKTOR
I
KOFAKTOREN
AUF
HUMANEN
MELANOMZELLEN
.
73
4.2.1.2.
NACHWEIS
VON
DAF
AUF
HUMANEN
MELANOMZELLEN
.
76
4.2.1.3.
NACHWEIS
VON
MAC-INHIBITOR
AUF
HUMANEN
MELANOMZELLEN
.
77
4.2.2.
BESTIMMUNG
DES
EINFLUSSES
VON
MEMBRANSTAENDIGEN
KOMPLEMENT
REGULATIONSFAKTOREN
AUF
DIE
KOMPLEMENTRESISTENZ
VON
MELANOMZELLEN
.
80
43.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
EXPRESSION
VON
C3
SPALTENDEN
SERINPROTEASEN
DURCH
HUMANE
MELANOMZELLEN
UND
DARAUS
RESULTIERENDE
STUDIEN
ZUR
EXPRESSION
SEKRETORISCHER
KOMPLEMENTPROTEINE
.
86
4.3.1.
ERSTELLUNG
EINER
LAMBDA
ZAP
EXPRESS
GENBANK
_
_
_
86
4.3.2.
PCR-STUDIEN
ZUR
EXPRESSION
VON
SERIN-PROTEASEN
DURCH
HUMANE
MELANOM
ZELLEN
.
79
4.3.3.
EXPRESSION
VON
FAKTOR
I
DURCH
HUMANE
MELANOMZELLEN
91
4.3.3.1.
NACHWEIS
VON
FAKTOR
I
CDNA-SEQUENZEN
IN
SK-MEL-170
GEN
BANKEN
DURCH
PCR
UND
SEQUENZIERUNG
.
-
.
91
4.3.3.2.
NACHWEIS
DER
FAKTOR
I
MRNA
IN
HUMANEN
MELANOMZELLEN
_
93
4.3.3.3.
NACHWEIS
VON
FAKTOR
I
IN
HUMANEN
MELANOMZELLEN
DURCH
IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE
.
-
94
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.3.4.
NACHWEIS
DER
FAKTOR
I-SEKRETION
DURCH
HUMANE
MELANOMZELLEN
_
96
4.3.4.
EXPRESSION
VON
FAKTOR
H
DURCH
HUMANE
MELANOMZELLEN
.
97
4.3.4.1.
NACHWEIS
DER
FAKTOR
H
CDNA-SEQUENZ
IN
SK-MEL-170
CDNA-
GENBANKEN
DURCH
PCR
UND
SEQUENZIERUNG
.
97
4.3.4.2.
NACHWEIS
DER
FAKTOR
H
MRNA
IN
HUMANEN
MELANOMZELLEN
.
98
4.3.4.3.
NACHWEIS
VON
FAKTOR
H
IN
HUMANEN
MELANOMZELLEN
DURCH
IMMUNFLUORESZENZ
.
98
4.3.4.4.
NACHWEIS
DER
FAKTOR
H
SEKRETION
DURCH
HUMANE
MELANOMZELLEN_
101
4.4.
EXPRESSION
VON
KOMPLEMENT
C3
DURCH
HUMANE
MELANOMZELLEN
.
102
4.4.1.
NACHWEIS
DER
KOMPLEMENT
C3
CDNA-SEQUENZ
IN
SK-MEL-170
CDNA-GENBANKEN
DURCH
PCR
UND
SEQUENZIERUNG
.
102
4.4.2.
NACHWEIS
DER
KOMPLEMENT
C3
MRNA
IN
HUMANEN
MELANOM
ZELLEN
.
103
4.4.3.
NACHWEIS
DER
KOMPLEMENT
C3
SEKRETION
DURCH
HUMANE
MELANOM
ZELLEN
.
.
.
104
5.
DISKUSSION
.
105
5.1.
KOMPLEMENTRESISTENZ
HUMANER
MELANOMZELLEN
.
105
5.2.
EXPRESSION
VON
FAKTOR
I,
FAKTOR
H
UND
C3
DURCH
HUMANE
MELANOMZELLEN
.
109
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
.113
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
114
8.
ANHANG
.
123 |
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