Herstellung und Analyse normalisierter cDNA-Banken:
Saved in:
| Main Author: | |
|---|---|
| Format: | Book |
| Language: | German |
| Published: |
München
Utz, Wiss.
1997
|
| Series: | Biochemie
|
| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Item Description: | Zugl.: München, Univ., Fak. für Chemie und Pharmazie, Diss., 1997 |
| Physical Description: | IV, 180 S. graph. Darst. |
| ISBN: | 3896752413 |
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
7
2.1
MATERIAL
.
7
2.1.1
GERAETE
.
.7
2.1.2
CHEMIKALIEN
.
9
2.1.3
ENZYME
UND
ANTIKOERPER
.
14
2.1.4
ORGANISMEN
.
15
2.1.5
PLASMIDE
.
16
2.1.6
OLIGONUKLEOTIDE
.
16
2.1.7
DNA-MOLEKULARGEWICHTSTANDARDS
.
17
2.1.8
KITS
.
18
2.1.9
VERBRAUCHSMATERIALIEN
UND
ZUBEHOER
.
19
2.1
METHODEN
.
22
2.2.1
KULTURTECHNIKEN
.
22
2.2.1.1
ANZUCHT
VON
ESCHERICHIA
COLI
KULTUREN
.
22
2.2.1.2
ANZUCHT
VON
HEFEKULTUREN
.
23
2.2.1.3
ANLEGEN
VON
DAUERKULTUREN
IN
GLYZERIN
ODER
DMSO
.
23
2.2.2
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
DURCH
ELEKTROPORATION
.
23
2.2.2.1
HERSTELLEN
ELEKTROKOMPETENTER
ZELLEN
.
23
2.2.2.2
ELEKTROPORATION
.
24
2.2.2.3
SELEKTION
POSITIVER
TRANSFORMANDEN
.
25
2.2.3
ISOLIEREN
UND
REINIGEN
VON
PLASMID-DNA
.
25
2.2.3.1
ISOLIEREN
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
DURCH
"ALKALISCHE
LYSE"
.
25
2.2.3.2
REINIGUNG
VON
PLASMIDPRAEPARATIONEN
AUS
E.
COLI
NACH
DEM
QIAGEN-PROTOKOLL
.
27
2.2.3.3
ISOLIEREN
UND
REINIGEN
VON
PLASMID-DNA
NACH
DEM
PROTOKOLL
VON
INVITROGEN
.
28
2.2.3.4
PHENOLEXTRAKTION
VON
NUKLEINSAEUREN
.
29
2.2.3.5
ETHANOLFAELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
AUS
WAESSRIGEN
LOESUNGEN
.
30
2.23.6
ISOPROPANOLFAELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
AUS
WAESSRIGEN
LOESUNGEN
.
31
2.2.3.7
PROTEINASE
K-BEHANDLUNG
.
31
2.2.3.8
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA-HALTIGEN
LOESUNGEN
.
32
2.2.4
VOLLSTAENDIGE
RESTRIKTIONSHYDROLYSE
.
33
2.2.5
DEPHOSPHORYLIEREN
VON
DNA
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
AUS
KAELBERDARM
.
34
2.2.6
AUFFUELLEN
5'-UEBERSTEHENDER
DNA-ENDEN
.
35
2.2.7
AMPLIFIZIEREN
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
DIE
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
36
2.2.8
REINIGEN
VON
OLIGODESOXY
BZW.
OLIGORIBONUKLEOTIDEN
.
37
2.2.9
HERSTELLEN
VON
ADAPTOREN
.
39
2.2.10
LIGATION
VON
DNA
.
39
2.2.11
MIKRODIALYSE
VON
DNA-HALTIGEN
LOESUNGEN
.
40
2.2.12
BLOCKIEREN
VON
DYNABEADS-M-280-STREPTAVIDIN
.
40
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.13
BLOCKIEREN
VON
EPPENDORF-REAKTIONSGEFAEBEN
.
41
2.2.14
HITZEDENATURIEREN
VON
DOPPELSTRAENGIGEN
DNA-FRAGMENTEN
.
41
2.2.15
ALKALISCHES
DENATURIEREN
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
42
2.2.16
KOPPELN
VON
BIOTIN-ENDMARKIERTEN
DNA-FRAGMENTEN
AN
DYNABEADS
M-280
STREPTAVIDIN
.
42
2.2.16.1
WASCHEN
DER
DYNABEADS
M-280-STREPTAVIDIN
.
42
2.2.16.2
BINDEN
DER
DNA-FRAGMENTE
.
.43
2.2.17
DNA-DNA-SELBSTSUBTRAKTION
AN
EINER
FESTEN
PHASE
.
43
2.2.18
DNA-ZWEITSTRANGSYNTHESE
.
44
2.2.18.1
DNA-ZWEITSTRANGSYNTHESE
MIT
P/U-DNA-POLYMERASE
.
44
2.2.18.2
DNA-ZWEITSTRANGSYNTHESE
MIT
KLENOW-ENZYM
.
.45
2.2.19
HERSTELLEN
VON
IN
VITRO-TRANSKRIPTEN
.
46
2.2.19.1
HERSTELLEN
VON
NICHTMARKIERTEN
ODER
NICHT-RADIOAKTIV
MARKIERTEN
IN
VITRO
TRANSKRIPTEN
.
46
2.2.19.2
HERSTELLEN
VON
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
IN
VITRO-TRANSKRIPTEN
.
47
2.2.20
MODIFIKATION
DER
ENDEN
SYNTHETISCHER
TRANSKRIPTE
.
49
2.2.20.1
ENTFERNEN
DER
5'-CAP-STRUKTUR
MIT
SAURER
PYROPHOSPHATASE
AUS
TABAKBLAETTERN
.
49
2.2.20.2
BLOCKIEREN
DER
3'-ENDEN
VON
TRANSKRIPTEN
DURCH
POLY(A)-POLYMERASE
UND
CORDYCEPIN-5'-TRIPHOSPHAT
.
49
2.2.21
LIGATION
VON
EINZELSTRAENGIGEN
RNA-MOLEKUELEN
MIT
T4-RNA-LIGASE
.
.50
2.2.22
CDNA-ERSTSTRANGSYNTHESE
.
51
2.2.23
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
52
2.2.23.1
HERSTELLEN
EINES
AGAROSEGELES
.
52
2.2.23.2
PROBENVORBEREITUNG
.
53
2.2.23.3
ELEKTROPHORESEBEDINGUNGEN
.
53
2.2.24
ISOLIEREN
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
54
2.2.24.1
ISOLIEREN
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
NACH
DER
"FREEZE-THAW
METHODE"
.
54
2.2.24.2
ISOLIEREN
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
"LOW-MELTING-POINT-AGAROSE"
UNTER
VERWENDUNG
VON
BETA-AGARASE
.
54
2.2.25
TRANSFER
VON
DNA
AUS
EINEM
AGAROSEGEL
AUF
EINE
NYLONMEMBRAN
.
55
2.2.25.1
ALKALISCHER
KAPILLARBLOT
.
55
2.2.25.2
BLOTTEN
UNTER
TROCKNEN
DES
GELS:
"TROCKEN-BLOT"
.
56
2.2.25.3
DNA-DOT-BLOT
.
57
2.2.26
HERSTELLEN
VON
RADIOAKTIV
ODER
NICHT-RADIOAKTIV
MARKIERTEN
HYBRIDISIERUNGS
SONDEN
DURCH
"RANDOM-HEXAMER-PRIMING"
.
58
2.2.27
HYBRIDISIEREN
MIT
MARKIERTEN
DNA-FRAGMENTEN
.
60
2.2.28
ENTFERNEN
RADIOAKTIV
MARKIERTER
HYBRIDISIERUNGSSONDEN
VON
EINER
MEMBRAN
.
61
2.2.29
NICHTRADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG
VON
KLONIERTER
CDNA
NACH
DEM
MULTIPLEX
VERFAHREN
.
62
2.2.29.1
BEREITSTELLEN
VON
PLASMIDGEMISCHEN
ZUR
MULTIPLEXSEQUENZIERUNG
.
62
2.2.29.2
ENZYMATISCHE
DNA-SEQUENZIERUNG
VON
MULTIPLEXGEMISCHEN
.
62
INHALTSVERZEICHNIS
UI
2.2.29.3
HERSTELLEN
EINES
SEQUENZGELES
.
64
2.2.29.4
ELEKTROPHORESE
.
65
2.2.29.5
HALBAUTOMATISCHER
NACHWEIS
VON
DNA-SEQUENZIERUNGSPRODUKTEN
DURCH
HYBRIDISIERUNG
UNTER
VERWENDUNG
EINES
MEMBRANPROZESSORS
.
66
2.2.29.5.1
TRANSFER
DER
DNA
AUF
EINE
NYLONMEMBRAN
.
66
2.2.29.5.2
HERSTELLEN
DIGOXIGENINMARKIERTER
HYBRIDISIERUNGSSONDEN
.
66
2.2.29.5.3
HYBRIDISIEREN
UND
NICHTRADIOAKTIVER
NACHWEIS
DER
SEQUENZIERUNGSPRODUKTE
DURCH
CHEMILUMINESZENZ
.
.67
2.2.30
COMPUTERANALYSEN
.
70
3.
ERGEBNISSE
.
71
3.1
ENTWICKLUNG
EINES
MODELLSYSTEMS
ZUR
DURCHFUEHRUNG
UND
ANALYSE
VON
REASSOZIATIONSEXPERIMENTEN
.
71
3.1.1
ANALYSE
VON
REASSOZIATIONSEXPERIMENTEN
DURCH
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
71
3.1.2
DEFINIEREN
VON
MODELLKOMPONENTEN
ZUR
DURCHFUEHRUNG
VON
REASSOZIATIONS
EXPERIMENTEN
.
73
3.2
DARSTELLUNG
DER
REASSOZIATION
VON
DNA-MODELLFRAGMENTEN
UNTERSCHIEDLICHER
KONZENTRATIONEN
.
75
3.2.1
VERGLEICH
DER
REASSOZIATION
EINES
HOCH-KONZENTRIERTEN
UND
EINES
MAESSIG
KONZENTRIERTEN
DNA-MODELLFRAGMENTES
.
75
3.2.2
REASSOZIATIONSVERHALTEN
EINES
NIEDRIG-KONZENTRIERTEN
DNA-FRAGMENTES
IM
MODELLSYSTEM
.
78
3.3
EINFLUSS
VON
HINTERGRUND-DNA
IM
MODELLSYSTEM
.
80
3.4
ANLEGEN
EINER
HEFE-CDNA-BANK
IM
VEKTOR
PBSIISK-XKASC
.
82
3.5
HERSTELLEN
EINER
NORMALISIERTEN
CDNA-BANK
DURCH
DNA-DNA-SELBSTSUBTRAKTION
AN
FESTER
PHASE
.
.85
3.5.1
HERSTELLEN
"FESTPHASENGEKOPPELTER
CDNA-BANKEN"
.
85
3.5.2
DNA-DNA-SELBSTSUBTRAKTION
AN
FESTER
PHASE
UND
SPEZIFISCHES
KLONIEREN
DER
NORMALISIERTEN
CDNA
.
89
3.5.3
ANALYSE
NORMALISIERTER
CDNA-BANKEN
DURCH
HYBRIDISIEREN
MIT
EINER
SPEZIFISCHEN
GENSONDE
.
90
3.6
HERSTELLUNG
NORMALISIERTER
CDNA-BANKEN
DURCH
TRANSKRIPTGETRIEBENE
SUBTRAKTION
.
95
3.6.1
ABHAENGIGKEIT
DER
DNA-RNA-HYBRIDBILDUNG
VON
DER
NATRIUMCHLORIDKONZENTRATION
.95
3.6.2
HERSTELLEN
EINER
NORMALISIERTEN
CDNA-BANK
DURCH
TRANSKRIPTGETRIEBENE
SUBTRAKTION.
.98
3.6.3
QUALITATIVE
ANALYSE
DER
NORMALISIERTEN
MODELL-CDNA-BANK
.
102
3.6.4
QUANTITATIVE
ANALYSE
DER
NORMALISIERTEN
MODELL-CDNA-BANK
.
105
3.6.5
ANALYSE
DER
QUALITAET
DER
NORMALISIERTEN
CDNA-BANK
.
107
3.6.6
ANALYSE
DES
NORMALISIERUNGSGRADES
DER
ERHALTENEN
KOMPLEXEN
HEFE-CDNA-BANK.LO8
3.6.7
ABHAENGIGKEIT
DER
SIGNALINTENSITAET
VON
DER
KONZENTRATION
EINER
HYBRIDISIERUNGS
SONDE,
DIE
DURCH
"RANDOM
HEXAMER
PRIMING"
AN
DOPPELSTRAENGIGER
CDNA
HERGESTELLT
WURDE
.
111
3.7
NICHTRADIOAKTIVE,
ENZYMATISCHE
SEQUENZIERUNG
VON
CDNA-3'-ENDEN
NACH
DEM
MULTIPLEXVERFAHREN
.
113
3.7.1
HERSTELLEN
GEEIGNETER
MULTIPLEXVEKTOREN
.
113
IV
INHALTSVERZEICHNIS
3.7.2
UMWANDELN
EINER
NORMALISIERTEN
CDNA-BANK
IN
MULTIPLEXFAEHIGE
CDNA-BANKEN
.115
3.7.3
SPEZIFISCHER
NACHWEIS
VON
CDNA-3'-SPEZIFISCHEN
SEQUENZIERUNGSPRODUKTEN
IM
MULTIPLEXSYSTEM
.
118
3.7.4
GERICHTETE
SEQUENZIERUNG
VON
CDNA
NACH
DEM
MULTIPLEXVERFAHREN
.
121
4.
DISKUSSION
.
127
4.1
MODELLSYSTEM
ZUR
DURCHFUEHRUNG
VON
NORMALISIERUNGSEXPERIMENTEN
.
127
4.2
REAKTIONSBEDINGUNGEN
ZUR
DURCHFUEHRUNG
VON
NORMALISIERUNGSEXPERIMENTEN
.
128
4.3
EINE
BEREITS
BESTEHENDE
CDNA-BANK
ALS
AUSGANGSMATERIAL
ZUR
HERSTELLUNG
NORMALISIERTER
CDNA-BANKEN
.
129
4.4
FESTPHASEGEKOPPELTE
CDNA-BANKEN
.
131
4.5
DIE
KLONIERUNG
DER
NORMALISIERTEN
KOMPONENTE
.
132
4.6
CHARAKTERISIERUNG
DER
NORMALISIERTEN
CDNA-BANKEN
.
132
4.7
HERSTELLEN
NORMALISIERTER
CDNA-BANKEN
DURCH
TRANSKRIPTGETRIEBENE
SUBTRAKTION
.
133
4.8
DNA-RNA-HYBRIDBILDUNG
IN
KONKURRENZ
ZUR
DNA-DNA-RENATURIERUNG
.
134
4.9
KLONIERUNGSARTEFAKTE
.
135
4.10
ANALYSE
DER
GENBANKEN
.
136
4.11
VERGLEICH
DER
BEIDEN
METHODEN
.
138
4.12
VERGLEICH
MIT
WEITEREN
NORMALISIERUNGS-METHODEN
.
139
4.13
ZUSAMMENFASSENDE
BEURTEILUNG
.
142
4.14
HERSTELLEN
MULTIPLEXFAEHIGER
CDNA-BANKEN
.
143
4.15
ANALYSE
MULTIPLEXFAEHIGER
CDNA-BANKEN
.
144
4.16
WEITERE
ENTWICKLUNGEN
UND
AUSBLICK
.
147
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
148
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
150
7.
ANHANG
I:
HERSTELLEN
VON
CDNAS
VOLLER
LAENGE
.
155
7.1
PUFFERZUSAMMENSETZUNG
FUER
DIE
LIGATION
EINES
OLIGORIBONUKLEOTIDES
AN
DAS
5'-ENDE
EINES
IN
VR'RRO-TRANSKRIPTES
.
155
7.2
OPTIMIEREN
DER
REAKTIONSBEDINGUNGEN
ZUR
LIGATION
EINES
OLIGORIBONUKLEOTIDES
AN
DAS
5'-ENDE
EINES
IN
VITRO-TRANSKRIPTES
.
158
7.3
EFFIZIENZ
DER
T4-RNA-LIGASEREAKTION
NACH
BEHANDLUNG
DES
SUBSTRATES
MIT
SAURER
PYROPHOYPHATASE
AUS
TABAKBLAETTEN
(TAP)
.
159
7.4
ERZEUGUNG
UND
NACHWEIS
VON
CDNAS
VOLLER
LAENGE
IM
MODELLSYSTEM
.
162
8.
ANHANG
II:
ANALYSEERGEBNISSE
EINZELNER
SEQUENZDATEN
.
167
9.
ANHANG
III:
AUFLISTUNG
ALLER
OFFENEN
LESERAHMEN
IM
GENOM
DER
HEFE
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE,
DIE
IN
DIESER
ARBEIT
DURCH
SEQUENZIERUNG
VON
CDNA-3'-ENDEN
BESTAETIGT
WURDEN
.
171 |
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