Untersuchungen zur symbiosespezifischen Glucoseausscheidung des Photobionten Nostoc spec. aus der Flechte Peltigera horizontalis:
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| adam_text | UNTERSUCHUNGEN ZUR SYMBIOSESPEZIFISCHEN GLUCOSE- AUSSCHEIDUNG DES
PHOTOBIONTEN NOSTOC SPEC. AUS DER FLECHTE PELTIGERA HORIZONTALIS
DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR.
RER. NAT. ) DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET HI - BIOLOGIE UND
VORKLINISCHE MEDIZIN - DER UNIVERSITAET REGENSBURG VORGELEGT VON ROBERT
WASTLHUBER AUS MUEHLDORF AM INN 1996 INHALTSVERZEICHNIS 1. EINLEITUNG UND
PROBLEMSTELLUNG 1 1.1. HISTORISCHES 1 1.2. ZUR DEFINITION DER FLECHTE 1
1.3. DIE BEZIEHUNG ZWISCHEN MYCOBIONT UND PHOTOBIONT 2 1.4. DIE FLECHTEN
ALS OBJEKTE AUSGEWAEHLTER FORSCHUNGSRICHTUNGEN 3 1 .4.1. DIE ZELLWAENDE
DER BIONTEN UND IHRE KONTAKTE 4 1.4.2. CYTOLOGISCHE UNTERSCHIEDE VON
LICHENISIERTEN UND KULTIVIERTEN BIONTEN 5 1.4.3. KULTUR- UND
RESYNTHESEVERSUCHE 5 1.4.4. FLECHTEN UND MOLEKULARBIOLOGIE 6 1.5. DER
KOHLENHYDRATTRANSFER IN DEN FLECHTEN 6 1.6. ZUM INHALT DER VORLIEGENDEN
ARBEIT 9 2. MATERIALIEN 10 2.1. CHEMIKALIEN, ENZYME UND KITS 10 2.2.
GERAETE UND SONSTIGE MATERIALIEN 11 2.3. ORGANISMEN 11 2.3.1. ESCHERICHIA
COW-STAEMME 11 2.3.2. FLECHTEN 12 2.3.3. CYANOBAKTERIEN 12 2.4. MEDIEN,
ANZUCHTBEDINGUNGEN UND DAUERKULTUREN 12 2.5. VEKTOREN 13 2.6. PUFFER UND
LOESUNGEN 13 3. METHODEN 14 3.1. GEWINNUNG FRISCH ISOLIERTER NOSTOC 14
3.1.1. LOESUNGEN 14 3.1.2. REINIGUNG DER FLECHTEN 14 3.1.3. ISOLIERUNG
DER MWFOC-ZELLEN 14 3.2. INKULTURNAHME DER ZELLEN 15 3.3.
ZELLAUFSCHLUESSE ZUR AKTIVITAETSBESTIMMUNG LOESLICHER ENZYME 15 3.4.
BESTIMMUNG DER ENZYMAKTIVITAETEN 15 3.4.1. ADP-GLUCOSE-PYROPHOSPHORYLASE
16 3.4.2. GLYKOGENSYNTHASE 16 3.4.3. PHOSPHOGLUCOMUTASE 16 3.4.4.
HEXOKINASE . 16 3.4.5. D-ENZYM UND MALTESE 16 3.4.6. AMYLASE 16 3.4.7.
PHOSPHATASE 16 3.4.8. PHOSPHORYLASE 17 3.5. FIXIERUNG VON 14 CO2,
AUSSCHEIDUNG VON M C-GLUCOSE 1 7 3.5.1. STANDARDANSAETZE 17 3.5.2.
MODIFIZIERTE ANSAETZE 17 3.6. ENZYMATISCHE BESTIMMUNG DER INS MEDIUM
AUSGESCHIEDENEN GLUCOSE 17 3.7. ANALYSE DES AUSSCHEIDUNGSPRODUKTS FRISCH
ISOLIERTER NOSTOC UEBER TLC 18 3.7.1. VORBEHANDLUNG DER PROBEN 18 3.7.2.
ENTWICKLUNG DES CHROMATOGRAMMS 1 8 3.8. METABOLITENBESTIMMUNGEN 18
3.8.1. NACH BIELESKI (1982) 18 3.8.2. UEBER ETHANOLFAELLUNG 18 3.9.
ZUCKERAUFNAHME DURCH NOSTOC-ZELLEN 19 3.9.1. GLUCOSEAUFOAHME 19 3.9.2.
AUFNAHME VON 3-OMG 19 3.9.3. PH-ABHAENGIGKEIT DER GLUCOSEAUFHAHME 19
3.9.4. PROTEINBESTIMMUNG VON ZELLHYDROLYSATEN 20 3.10. BESTIMMUNG DES
UNZUGAENGLICHEN ZELLVOLUMENS 20 3.11. REINIGUNG DER FLECHTENSTOFFE ABER
HPLC 21 3.12. ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 21 3.12.1. ISOLIERUNG
GENOMISCHER DNA AUS NOSTOC 2 1 3.12.2. ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA 22
3.12.2.1. AUS KULTIVIERTER NOSTOC 22 3.12.2.2. AUS FRISCH ISOLIERTER
NOSTOC 22 3.12.2.3. AUS GANZEN THALLI VON PELTIGERA HORIZONTALIS 23
3.12.3. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 23 3.12.3.1.
MINIPRAEPARATION 23 3.12.3.2. MIDIPRAEPARATION 23 3.12.4. ISOLIERUNG VON
DNA AUS DEM PHAGEN X 23 3.13. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN
23 3.14. SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 24 3.15. WEITERE
ENZYMATISCHE KLONIERUNGSTECHNIKEN 24 3.16. TRANSFORMATION VON E. COLI .
24 3.16.1. HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN 24 3.16.2. DURCHFUEHRUNG DER
TRANSFORMATION 24 3.17. HORIZONTALE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 24 3.18.
ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS LMP-AGAROSEGELEN 25 3.19.
POLYMERASE-KETTENREAKTION (SAIKI ET AL. 1988) 25 3.19.1. AUSWAHL DER
PRIMER 25 3.19.2. DURCHFUHRUNG DER PCR-AMPLIFIKATION 26 3.19.3.
SUBKLONIEREN VON PCR-FRAGMENTEN 26 3.20. SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG MIT 32
P-MARKIERTER SONDE 26 3.20.1. UEBERFUHREN VON DNA-FRAGMENTEN AUF
NYLONFOLIE 26 3.20.2. MARKIERUNG UND REINIGUNG DER SONDE 27 3.20.3.
HYBRIDISIERUNGSBEDINGUNGEN 27 3.20.4. DETEKTION DER HYBRIDISIERTEN DNA
27 3.21. ANSAETZE ZUR KONSTRUKTION VON GENOMISCHEN GENBANKEN VON NOSTOC
AUS PELTIGERA HORIZONTALIS 27 3.21.1. PLASMID-BANKEN IN E. COLI 27
3.21.2. XGTLO-BANKEN 28 3.22. DURCHSUCHEN DER GENOMISCHEN X GTLO-GENBANK
VON NOSTOC SPEC. 28 3.23. REVERSE TRANSKRIPTION MIT ANSCHLIESSENDER PCR
29 3.23.1. AUFBEREITUNG DER EINGESETZTEN RNA 29 3.23.2. DURCHFUEHRUNG DER
REVERSEN TRANSKRIPTION 29 3.23.3. VORBEREITUNG DER ANSAETZE FUER DIE PCR
29 3.24. SEQUENZIEREN VON DNA 30 4. ERGEBNISSE 31 4.1. ISOLIERUNG,
INKULTURNAHME UND VITALITAET VON NOSTOC SPEC. AUS PELTIGERA 31 4.2. DIE
FIXIERUNG VON 14 CO2 UND DIE AUSSCHEIDUNG VON GLUCOSE 38 4.2.1.
STANDARDANSAETZE 38 4.2.2. MODIFIZIERTE ANSAETZE 41 4.3.
AKTIVITAETSBESTIMMUNGEN VON ENZYMEN DES KOHLENHYDRATMETABOLISMUS 42 4.4.
METABOLITENBESTIMMUNGEN 44 4.5. ZUCKERAUFNAHME BEI NOSTOC 45 4.6.
AUFSPUEREN GLUCOSETRANSPORTER-HOMOLOGER GENBEREICHE AUS NOSTOC MITTELS
PCR 48 4.6.1. VERSUCHE MIT NOSTOC AUS PELTIGERA HORIZONTALIS 48 4.6.2.
SOUTHERN-HYBRIDISIERUNGEN MIT DEN VIER PCR-FRAGMENTEN ALS SONDEN 54
4.6.3. VERGLEICHENDE PCR MIT DNA VON NOSTOC AUS PELTIGERA CANINA UND
PELTIGERA HORIZONTALIS 55 4.7. ANSAETZE ZUR KONSTRUKTION VON GENOMISCHEN
GENBANKEN VON NOSTOC AUS PELTIGERA HORIZONTALIS 56 4.7. 1 .
PLASMID-BANKEN IN E. COLI 56 4.7.2. XGTLO-BANKEN 56 4.8. DURCHSUCHEN
EINER GENOMISCHEN IVASTOC-GENBANK NACH GENEN FUER
GLUCOSETRANSPORTPROTEINE 58 4.8. 1 . DIE SONDE FR. 1. (KONTROLLE) 58
4.8.2. DIE SONDE FR.2. 59 4.8.3. DIE SONDE FR.3. 59 4.9. DIE SEQUENZ DES
POTENTIELLEN GLUCOSETRANSPORTERS GTNL AUS NOSTOC SPEC. 60 4.9.1.
LOKALISIERUNG VON FR.3 AUF DEM PLASMID PGTNL 60 4.9.2. NUKLEOTIDSEQUENZ
DES POTENTIELLEN GLUCOSETRANSPORTERS GTNL AUS NOSTOC 62 4.9.3.
AMINOSAEURESEQUENZANALYSE DER VERFUEGBAREN TEILSEQUENZ DES POTENTIELLEN
GLUCOSETRANSPORTPROTEINS GTNL 65 4.10. DIFFERENTIELLE TRANSKRIPTION
POTENTIELLER GLUCOSETRANSPORTER IN DEN VERSCHIEDENEN KULTURSTADIEN VON
NOSTOC 67 5. DISKUSSION 70 5.1. ISOLIERUNG DES CYANOBIONTEN NOSTOC AUS
DER FLECHTE PELTIGERA HORIZONTALIS; MIKROSKOPISCHE MERKMALE 70 5.2.
BIOCHEMISCHE UND PHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN AN FRISCH ISOLIERTEN UND
KULTIVIERTEN CYANOBIONTEN 71 5.3. MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN AN
POTENTIELLEN GLUCOSE-CARRIERN AUS DEM IVOSFOC-CYANOBIONTEN DER FLECHTE
P. HORIZONTALIS; SYNTHESE MIT DEN BIOCHEMISCHEN BEFUNDEN 76 5.4.
AUSBLICK 82 ABKURZUNGSVERZEICHNIS 6. ZUSAMMENFASSUNG 7.
LITERATURVERZEICHNIS 84 86 ABB AC ADPG AS BP BSA J U DNS DEPC EDTA ETOH
FCCP FG G GLC-6-P H HAC HEPES HPLC IPTG KB LMP MEOH MES MIN MOPS OD N
3-OMG PCR PEG PFII PGS PPM PVP RPM RT ABBILDUNG ACETAT ADP-GLUCOSE
AMINOSAEURE BASENPAARE RINDERSERUMALBUMIN *R.* LAG
3,5-DINITRO-SALICYLSAEURE DIETHYL-PYROCARBONAT
ETHYLENDIAMINTETRAESSIGSAEURE ETHANOL
CARBONYL-CYANID-P-TRIFLUOROMETHOXYPHENYLHYDRAZON FRISCHGEWICHT
ERDBESCHLEUNIGUNG, GRAMM GLUCOSE-6-PHOSPHAT STUNDE ESSIGSAEURE
N-2-HYDROXYETHYL-PIPERAZIN-N -2-ETHANSULFONSAEURE
HOCHDRUCK-FLUESSIGKEITS-CHROMATOGRAPHIE
ISOPROPYL-SS-D-THIOGALACTOPYRANOSID KILOBASENPAARE LOW MELTING POINT
METHANOL MORPHOLINOETHANSULFONSAEURE MINUTE
Y-MORPHOIINO-PROPANSULFONSAEURE OPTISCHE DICHTE BEI DER WELLENLAENGE N
3-O-METHYL-D-GLUCOSE POLYMERASE KETTENREAKTION POLYETHYLEN-GLYKOL PLAQUE
FORMING UNITS PHOSPHO-GLYCERINSAEURE PARTS PER MILLION
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TRANSKRIPTION
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