Biochemische und molekulargenetische Untersuchungen des N-Oligosaccharyltransferase-Komplexes aus Saccharomyces cerevisiae:
Gespeichert in:
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1997
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INHALTSVERZEICHNIS
1
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
.
5
1.
EINLEITUNG
.
6
1.1
ASSEMBLIERUNG
DES
LIPIDGEBUNDENEN
"CORE"-OLIGOSACCHARIDS
.
6
1.2
PROZESSIERUNG
N-GLYKOSIDISCH
GEBUNDENER
OLIGOSACCHARIDE
.
7
13
STRUKTURELLE
EIGENSCHAFTEN
DER
DONOR
UND
AKZEPTORSUBSTRATE
DER
N-GLYKOSYLIERUNG
.
9
1.4
ISOLIERUNGSVERSUCHE
DES
OLIGOSACCHARYLTRANSFERASE-KOMPLEXES
.
11
1.5
DER
OST-KOMPLEX
BEI
HOEHEREN
EUKARYONTEN
.
13
1.6
DER
OST-KOMPLEX
VON
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
14
1.7
KOMPONENTEN
DER N-GLYKOSYLIERUNG,
DIE
NICHT
ALS
STRUKTURELLE
UNTER
EINHEITEN
DES
OST-KOMPLEXES
ISOLIERT
WURDEN
.
17
1.8
HOMOLOGIEN
ZWISCHEN
PROTEINUNTEREINHEITEN
DES
OST-KOMPLEXES
VON
S.
CEREVISIAE
UND HOEHEREN
EUKARYONTEN
.
18
1.9
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
20
2.
ERGEBNISSE
.
21
2.1
ISOLIERUNG
DES OLIGOSACCHARYLTRANSFERASE-KOMPLEXES
DURCH
IMMUN
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
21
2.1.1
ISOLIERUNG
EINES
KOMPLEXES
AUS
4
PROTEINUNTEREINHEITEN
.
21
2.1.2
PARTIELLE
TRENNUNG
DES
KOMPLEXES
DURCH
DETERGENSAUSTAUSCH
.
26
2.1.3
ISOLIERUNG EINES ENZYMATISCH
AKTIVEN
KOMPLEXES
IN
GEGENWART
VON
PHOSPHOLIPIDEN
.
27
2.2
VERSUCHE
ZUR
KLONIERUNG
VON
OST1
.
30
2.2.1
EINE
SEQUENZANALYSE DES
N-TERMINUS
ZEIGT
HOMOLOGIE
ZU
RIBOPHORIN
1
.
30
2.2.2
DURCHSUCHEN
EINER
HEFE-GENBANK
MIT
EINEM ABGELEITETEN
OLIGONUKLEOTID
DES
N-TERMINUS
.
31
2.2.3
PCR-AMPLIFIKATION
EINES
GENOMISCHEN
FRAGMENTS
MIT
OLIGONUKLEOTIDEN
VON
INTERNEN
TRYPTISCHEN
PEPTIDEN
.
31
23
KLONIERUNG
UND
STRUKTURELLE EIGENSCHAFTEN VON
OST3
.
33
2.3.1
ISOLIERUNG
DES
GENS
DER
34
KDA
Y-UNTEREINHEIT
.
33
2.3.2
STRUKTURELLE EIGENSCHAFTEN
VON
OST3P
.
34
2.3.3
OST3P
ZEIGT
HOMOLOGIE
ZU
ATRAP
UND OFFENEN
LESERAHMEN
UNBEKANNTER
FUNKTION
BEI
HEFE
UND
CAENORHABDITIS
ELEGANS
.
35
2
INHALTSVERZEICHNIS
2.4
OST3
IST NICHT
ESSENTIELL
FUER
DIE
N-GLYKOSYLIERUNG
.
36
2.4.1
DIE
DISRUPTION
VON
OST3
IST
NICHT
LETAL
FUER
HAPLOIDE
HEFEZELLEN
.
36
2.4.2
DIE
OSZU-DISRUPTION
FUEHRT
ZU
EINER
GERINGEN
UNTERGLYKOSYLIERUNG
BESTIMMTER
ZELLULAERER
GLYKOPROTEINE
IN
VIVO
.
37
2.4.3
DIE
OST3-DISRUPTION
FUEHRT
ZU
REDUZIERTER
IN
VITRO
AKTIVITAET
DER
OLIGOSACCHARYLTRANSFERASE
.
40
2.4.4
DER
AUSFALL
VON
OST3P
BEEINFLUSST
NICHT
DIE
ZUSAMMENSETZUNG
DER
LIPIDGEBUNDENEN
OLIGOSACCHARIDE
.
42
2.4.5
DIE
DISRUPTION
VON
OST3
FUEHRT
ZU
EINER
VERAENDERTEN
PROTEIN
ZUSAMMENSETZUNG
DES
ISOLIERTEN
KOMPLEXES
.
43
2.4.6
EXPRESSION
WICHTIGER
TRANSLOKATIONSKOMPONENTEN IN
AOST3
.
44
2.4.7
DER
AUSFALL
VON
OST3P
ZEIGT
KEINEN
EFFEKT
AUF
DIE
IN
VIVO
GLYKOSYLIERUNG
EINZELNER
SEQUONS
EINES
AKZEPTORPROTEINS
.
45
2.4.8
UNTERSUCHUNG
WEITERER
ER-GEBUNDENER
ENZYMATISCHER
REAKTIONEN
IN
AOST3
.
48
2.5
IDENTIFIZIERUNG
VON
OST6
.
49
2.6
OST3
UND
OST6
STEHEN
IN
FUNKTIONELLEM
ZUSAMMENHANG
.
51
2.6.1
DISRUPTIONSSCHEMA
VON
OST6
.
51
2.6.2
DIE DISRUPTION
VON
OST6
FUEHRT
ZU
TEMPERATURABHAENGIGER
OSMOLABILITAET
UND
SENSITIVITAET
GEGENUEBER
"CALCOFLUOR
WHITE"
UND
CAFFEIN
.
51
2.6.3
DIE
OSTI/OSROE-DOPPELDISRUPTANTE
ZEIGT
EINE
STARKE
UNTERGLYKOSYLIERUNG
BESTIMMTER
GLYKOPROTEINE
IN
VIVO
.
54
2.6.4
KOMPLEMENTATIONSVERSUCHE DER
OSR3/OST6-DOPPELDISRUPTANTE
DURCH
"HIGH
COPY"
EXPRESSION
VON
OSTLP,
WBPLP
UND
SWPLP
.
59
2.6.5
DER
IN
VIVO
BEOBACHTETE
GLYKOSYLIERUNGSDEFEKT
DER
OITZ/OSROE-DOPPELDISRUP
TANTE
KORRELIERT
MIT
EINER
DRASTISCH
REDUZIERTEN
IN
VITRO
AKTIVITAET
DER
OST
.
59
2.6.6
DIE
DISRUPTION
VON
OST6
BEEINFLUSST
NICHT
DIE
ZUSAMMENSETZUNG
DER
LIPIDGEBUNDENEN
OLIGOSACCHARIDE
.
60
2.6.7
DER
AUSFALL
VON
OSTOEP ZEIGT
KEINEN
EFFEKT
AUF
DIE
IN
VIVO
GLYKOSYLIERUNG
EINZELNER
SEQUONS
EINES
AKZEPTORPROTEINS
.
62
2.6.8
DER
AUSFALL
VON
OSTOEP
FUEHRT
NICHT
ZU
EINER
VERAENDERTEN
ZUSAMMENSETZUNG
DES
ISOLIERTEN
KOMPLEXES
.
64
2.6.9
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FUNKTIONALITAET UND
INTEGRITAET
DES
ER
IN
DER
OS/6-EINFACH
UND
DER
OSF3/OS? 5-DOPPELDISRUPTANTE
.
66
2.7
VERSUCHE
ZUM
NACHWEIS
EINER
PHYSIKALISCHEN
INTERAKTION
ZWISCHEN
OST3P
UND
OSTOEP
DURCH
CHEMISCHE
QUERVERNETZUNG
.
66
2.8
VERSUCHE
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
MIT
OSTOEP
INTERAGIERENDER
PROTEINE
DURCH
IMMOBILISIERTE
METALL-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
OE8
2.8.1
ANFUEGEN
EINER
C-TERMINALEN
EXTENSION
AUS
6
HISTIDINRESTEN
AN
OSTOEP
UEBER
PCR
.
OE9
2.8.2
UEBERPRUEFUNG
DER
FUNKTIONALITAET
DES
OSTOEP-HISG-KONSTRUKTES
.
71
2.8.3
UEBERPRUEFUNG
DER
FUNKTIONALITAET
DES
TALON-SYSTEMS
UNTER
DEN
GEWAEHLTEN
BEDINGUNGEN
.
71
2.8.4
IMMOBILISIERTE
METALL-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
MIT
OSTOEP-HIS
.
72
INHALTSVERZEICHNIS
3
2.9
STT3P,
EIN
HOCH KONSERVIERTES TRANSMEMBRANPROTEIN,
IST
ESSENTIELL
FUER
DIE
AKTIVITAET
DER
OLIGOSACCHARYLTRANSFERASE
IN
VIVO
UND
IN
VITRO
.
74
2.9.1
IDENTIFIZIERUNG
VON
STT3
BEI DER
SUCHE
NACH NEUEN
KOMPONENTEN
DES
N-GLYKOSYLIERUNGSAPPARATES
.
74
2.9.2
EINE
WBPL
STT3
DOPPELMUTATION
FUHRT
ZU
EINER
STARKEN
UNTERGLYKOSYLIERUNG
SEKRETORISCHER
PROTEINE
IN
VIVO
.
75
2.9.3
DIE
STT3
MUTATION
BEEINFLUSST DIE
SUBSTRATSPEZIFITAET
DES
OST-KOMPLEXES
IN
VITRO
UND
IN
VIVO
.
75
2.9.4
DIE
ABSCHALTUNG
DER
S7T3-EXPRESSION
FUEHRT
ZU
EINER
FORTSCHREITENDEN
ABNAHME
DER
OST-AKTIVITAET
IN
VIVO
UND
IN
VITRO
.
76
2.9.5
DIE
ABSCHALTUNG
DER
S7T3-EXPRESSION
VERAENDERT
DIE PROTEINZUSAMMEN
SETZUNG
DES
ISOLIERTEN
OST-KOMPLEXES
.
78
2.9.6
STT3P
IST
EINE
NICHT
STOECHIOMETRISCHE
KOMPONENTE
DES
ISOLIERTEN
OST-
KOMPLEXES
.
79
2.10
OST2P
IST
EIN
BESTANDTEIL
DES
AFFINITAETSGEREINIGTEN
OST-KOMPLEXES
.
80
2.10.1
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
OST2P
IN
AFFINITAETSGEREINIGTEN
OST
KOMPLEXEN
AUS
S.
CEREVISIAE
.
80
2.10.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PHOSPHORYLIERUNG
VON
OST2P
.
81
3.
DISKUSSION
.83
4.
ZUSAMMENFASSUNG
.
100
5.
MATERIALIEN
.
104
5.1
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
.
104
5.2
ORGANISMEN,
PLASMIDE,
OLIGONUKLEOTIDE
.
106
6.
METHODEN
.
109
6.1
ANZUCHTBEDINGUNGEN
.
109
6.1.1
ANZUCHTBEDINGUNGEN
FUER
E.
COLI
.
109
6.1.2
ANZUCHTBEDINGUNGEN
FUER
S.
CEREVISIAE
.
109
6.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
109
6.2.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
.
109
6.2.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
S.
CEREVISIAE
.
110
6.2.3
ISOLIERUNG GENOMISCHER
DNA
AUS
S.
CEREVISIAE
.
110
6.2.4
KLONIERUNGSTECHNIKEN
.
HO
6.2.5
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
LMP-AGAROSE
.
110
6.2.6
TRANSFORMATION
IN
E.
COLI
.
111
6.2.7
TRANSFORMATION
IN
S.
CEREVISIAE
.
111
6.2.8
SEQUENZANALYSE
.
111
4
INHALTSVERZEICHNIS
6.2.9
PCR-AMPLIFIKATION
.
111
6.2.10
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
MIT
[Y
32
P]-ATP
.
112
6.2.11
NICHT-RADIOAKTIVE
DNA-MARKIERUNG
MIT
DIGOXIGENIN-DUTP
.
113
6.2.12
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
MIT
RADIOAKTIVEN
SONDEN
.
113
6.2.13
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
MIT
DIG-MARKIERTEN
SONDEN
.
113
6.2.14
"SOUTHERN
BLOT"-ANALYSE
.
114
6.3
BIOCHEMISCHE
METHODEN
.
115
6.3.1
MEMBRANPRAEPARATION
UND
SOLUBILISIERUNG
DER
OLIGOSACCHARYLTRANSFERASE
.
115
6.3.2
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
115
6.3.3
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
.
116
6.3.3.1
SYNTHESE
VON
DOLP-[
14
C]-MANNOSE
.
116
6.3.3.2
SYNTHESE
VON
DOLP-[
L4
C]-GLUKOSE
.
116
6.3.3.3
SYNTHESE
VON
DOLPP-[
14
C]-GLCNAC
UND
DOLPP-[
14
C]-GLCNAC
2
.
116
6.3.3.4
BESTIMMUNG
DER
N-OLIGOSACCHARYLTRANSFERASE-AKTIVITAET
.
117
6.33.5
BESTIMMUNG
DER
PROTEIN-O-MANNOSYLTRANSFERASE-AKTIVITAET
.
118
6.3.4
METABOLISCHE
MARKIERUNGEN
.
118
63.4.1
MARKIERUNG
MIT
[
35
S]-METHIONIN
.
118
63.4.2
LIPIDOLIGOSACCHARID-MARKIERUNG
MIT
[
3
H]-MANNOSE
.
119
6.3.5
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
.
119
63.5.1
11
WESTERN-BLOT"-ANALYSE
.
119
63.5.2
SILBERFAERBUNG
.
120
6.3.53
CHEMISCHE
QUERVEMETZUNG
.
120
63.5.4
DOC-TCA-FAELLUNG
VON
PROTEINEN
.
121
63.5.5
TRYPTISCHER
VERDAU
VON
PROTEINEN IN
SDS-POLYACRYLAMIDGELEN
.
121
63.5.6
N-GLYKOSIDASE-F-VERDAU
.
121
63.5.7
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
PROTEINEN MIT ALKALISCHER
PHOSPHATASE
UND
X-PHOSPHATASE
.
121
63.5.8
HERSTELLUNG
UND
REINIGUNG
EINES
REKOMBINANTEN
MBP:A250ST3P
FUSIONSPROTEINS
.
122
63.5.9
IMMOBILISIERTE
METALL-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
(IMAC)
.
123
6.3.5.10
ISOLIERUNG
DES
OLIGOSACCHARYLTRANSFERASE-KOMPLEXES
UEBER
IMMUN
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
123
63.5.11
KOVALENTE
KOPPLUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
AN
PROTEIN
A-SEPHAROSE
.
124
6.3.6
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
125
6.3.6.1
GEWINNUNG
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
REKOMBINANTES
MBP:A250ST3P
FUSIONSPROTEIN
.
125
63.6.2
GEWINNUNG
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
SYNTHETISCHE
PEPTIDE
.
125
6.3.63
INUNUNAFFINITAETSREINIGUNG
VON
ANTISEREN
.
126
7.
LITERATUR
.
127 |
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