Untersuchungen zur hormoninduzierten Destabilisierung der Transkripte des Speichelsekretproteingens Lgp-1 von Drosophila virilis:
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS I
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG
1
2. MATERIAL UND METHODEN
5
2.1
HERSTELLERNACHWEIS
5
2.2
ALLGEMEINE LOESUNGEN
6
2.3 PUFFER UND MEDIEN
7
2.4 FLIEGEN-, BAKTERIENSTAEMME, VEKTOREN, PLASMIDE
UND OLIGONUKLEOTIDE
8
2.5 COMPUTER HARD- UND SOFTWARE
11
2.6 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 12
2.6.1 ARBEITEN MIT DNA
12
2.6.1.1 PLASMIDISOLATION AUS
E. COLI-ZELLEN 12
2.6.1.2 PRAEPARATION HOCHMOLEKULARER GENOMISCHER DNA AUS
DROSOPHILA
13
2.6.1.3 ENZYMATISCHES SCHNEIDEN DOPPELSTRAENGIGER DNA 13
2.6.1.4 GELELUTION VON DNA-FRAGMENTEN AUS TBE-GELEN
14
2.6.1.5 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN
14
2.6.1
.6
DEPHOSPHORILIEREN VON DNA-FRAGMENTEN 14
2
.
6
.1.7 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 15
2.6.1
.8
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 15
2.6.1.9
SOUTHERN BLOT 15
2.6.1.10 HERSTELLEN RADIOAKTIV MARKIERTER DNA-SONDEN 16
2.6.1.11 HERSTELLEN NICHTRADIOAKTIV MARKIERTER DNA-SONDEN
NACH DER DIGOXIGENIN-METHODE 16
2.6.1.12
SITE SPECIFIC MUTAGENESIS ZUM ERZEUGEN EINER DELETION 17
2.6.1.13 DNA-SEQUENZIERUNG 19
2.6.1.14 AUFFUELLEN VON DNA-UEBERHAENGEN 19
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS II
2
.
6.2
2
.
6
.
2.1
2
.
6
.
2.2
2
.
6
.
2.3
2
.
6
.
2.4
2
.
6
.
2
.
4.1
2
.
6
.
2
.
4.2
2
.
6
.
2
.
4.3
2
.
6
.
2.5
2
.
6
.
2.6
2
.
6.27
2
.
6
.
2.8
2
.
6.3
2
.
6
.
3.1
2
.
6
.
3.2
2
.
6
.
3.3
2.7
2
.
7.1
2
.
7.2
2
.
7.3
2
.
7.4
2
.
7.5
2
.
7
.
5.1
27
.
5.2
27
.
5.3
ARBEITEN MIT RNA
ISOLATION VON GESAMT-RNA AUS SPEICHELDRUESEN
DENATURIERENDE AGAROSEGEL-ELELEKTROPHORESE VON RNA
NORTHERN BLOT
HOCHAUFLOESENDE
NORTHERN BLOTS
SCHNEIDEN UND DEADENYLIEREN VON RNA
ACRYLAMIDGEL UND ELEKTROPHORESE FUER HOCHAUFLOESENDE
NORTHERN BLOTS
^
TANK-BLOTTING
DER HOCHAUFLOESENDEN GELE
ABKOCHEN VON NYLONMEMBRANEN ZUR ERNEUTEN HYBRIDISIERUNG
19
19
20
20
20
21
21
22
MIT MARKIERTEN DNA-PROBEN
S1 NUKLEASE
ASSAY
HERSTELLEN SYNTHETISCHER RNAS
NUKLEASE
ASSAY
ARBEITEN MIT
ESCHERICHIA COLI DH5A
'HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN
TRANSFORMATION
DAUERKULTUREN
CYTOLOGISCHE METHODEN
WHOLE MOUNT-IN
S/FU-HYBRIDISIERUNG
IN
V/FRO-LNKUBATIONEN VON SPEICHELDRUESEN
HERSTELLUNG VON CYTOSOLISCHEN S130-EXTRAKTEN
PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD
P-ELEMENT TRANSFORMATION
VORBEREITUNG FUER DIE INJEKTION
INJEKTION
AUFZUCHT DER TRANSFORMANTEN
22
22
22
25
25
25
26
26
26
26
26
26
27
28
28
29
30
INHALTSVERZEICHNIS
III
3. ERGEBNISSE 32
3.1 VORARBEITEN 32
3.2 EIGENE ARBEITEN 35
V
3.2.1 CHARAKTERISIERUNG DER TRANSFORMANTENLINIEN
PLGP- 1/EGP- 1/LGP-1
UND PLGP-1/EGP-1 35
3.2.2
IN V/FRO-STUDIEN ZUM EINFLUSS VON RNA- UND
PROTEINSYNTHESE-INHIBITOREN AUF DEN
LGP-1-MRNA TUMOVER 36
3.2.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR SPEZIFISCHEN WIRKUNG
VON HEMMSTOFFEN IM
IN VITRO-SYSTEM 39
3.2.4 HOCHAUFLOESENDE ANALYSE DER
LGP-1-MRNA DEADENYLIERUNG 45
3.2.5 ANALYSE DER NUKLEASE-AKTIVITAET IN SPEICHELDRUESEN 49
3.2.5.1 ENTWICKLUNG EINES NUKLEASE-ASSAYS 50
3.2.5.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR NUKLEASE-INDUKTION DURCH ECDYSON 53
3.2.5.3 CHARAKTERISIERUNG DER DEGRADATION DES TRANSKRIPTKORPUS
VON
LGP-1-MRNAS 60
3.2.5.4 UNTERSUCHUNG ZUR ABHAENGIGKEIT DER NUKLEASE-INDUKTION
VON TRANSKRIPTION 64
3.2.5.5 TEST AUF HEMMBARKEIT DER INDUZIERTEN NUKLEASEN
MIT RIBONUKLEASE-INHIBITOR 65
3.2.5.6 DEGRADATION SYNTHETISCHER RNAS IM NUKLEASE-ASSAY 67
3.2.6
TRAILER-SEQUENZVERGLEICH MIT ANDEREN
SPEICHELSEKRETPROTEINGENEN 70
3.2.7 UNTERSUCHUNG VON TRANSFORMANTEN MIT
VERAENDERTEM TGCAT-MOTIV 71
3.2.7.1 KONSTRUKTION DER TRANSFORMANTE
LGP- F/ATGCATT 72
3.2.7.2 CHARAKTERISIERUNG DER MUTANTEN DES TGCAT-MOTIVS 73
INHALTSVERZEICHNIS
IV
4. DISKUSSION
5. ZUSAMMENFASSUNG
6. LITERATUR
7. ANHANG
ABKUERZUNGEN
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF
77
92
93
102
102
104
105 |
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