Zellzyklusabhängige Regulierung der DNA-Replikationsaktivität von DNA-Polymerase-alpha-Primase:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München
Utz, Wiss.
1997
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: München, Univ., Fak. für Chemie und Pharmazie, Diss., 1997 |
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INHALTSANGABE
I
INHALTSANGABE
1.
EINLEITUNG.
1
1.1.
DIE
ROLLE
VON
CYCLINEN
UND
CYCLIN
ABHAENGIGEN
KINASEN
IM
ZELLZYKLUS
.
2
1.2.
EUKARYONTISCHE
DNA-REPLIKATION
.
5
1.3.
DAS
SV40
SYSTEM
ALS
MODELL
ZUR
DNA-REPLIKATION
.
8
1.4.
ZELLULAERE
REPLIKATIONSPROTEINE
.
10
1.5.
AUFGABENSTELLUNG
.
13
2.
MATERIALIEN
UND
GERAETE
.
14
2.1.
ZELLINIEN
.
14
2.2.
BAKTERIEN
.
.
.
14
2.3.
PLASMIDE
.
.
.
15
2.4.
DNA,
DNA-LAENGENSTANDARDS
.
.
_
.15
2.5.
MOLEKULARGEWICHTSMARKER
.
15
2.6.
ENZYME
UND
PROTEINE
.
16
2.6
1.
RESTNKTIONSENZYME
.
16
2.6.2
ANDERE
ENZYME
.
16
2.6
3.
PROTEINE
UND
OLIGOPEPTIDE
.
16
2.7.
ANTIKOERPER
.
17
2.8.
BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM
.
17
2.8.1.
INSEKTENZELLEN
.
17
2.8
2
VERWENDETE
VINIS-STOCKLOSUNGEN
.
18
2.9.
CHEMIKALIEN
UND
ANDERE
MATERIALIEN
.
18
2.10.
GERAETE
.
19
2.11.
SAEULENMATERIALIEN
.
19
II
INHALTSANGABE
2.12.
MEDIEN
.
YY
.20
2.13.
PUFFER
.
20
2.14.
COMPUTERPROGRAMME
.
20
3.
METHODEN
_
_
21
3.1.
ZELLKULTUR
.
21
3.1.1.
KULTIVIERUNG
VON
SAUGERZELLEN
.
21
3.1.2.
KULTIVIERUNG
VON
INSEKTENZELLEN
.
22
3.1.3.
EINFRIEREN,
LAGERUNG
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
.
22
3.1.4.
SYNCHRONISIEREN
VON
ZELLEN
.
23
3
1.5
FACS
ANALYSE
VON
SYNCHRONISIERTEN
ZELLEN.
23
3.2.
ARBEITEN
MIT
BAKTERIEN
_
_
.
_
.
.
24
3.2
1.
VERMEHRUNG
VON
BAKTERIEN
IN
FLUESSIGKULTUR
.
24
3.2.2.
BESTIMMUNG
DER
OPTISCHEN
DICHTE
VON
FLUESSIGKULTUREN
.
24
3.2.3.
AUFBEWAHRUNG
VON
BAKTERIEN
.
24
3.2
4
HERSTELLUNG
TRANSFONNATIONSKOMPETENTER
BAKTERIEN
.
24
3.3.
ARBEITEN
MIT
DNA
.
25
3.3
1.
PHENOLEXTRAKTION
UND
FAELLUNG
VON
DNA
.
25
3.3.2
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
25
3.3.3.
PRAEPARATION
VON
DNA
.
26
3.3.3.1.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
BAKTERIEN
.
26
3.3.3
2
DNA-ISOLIERUNG
AUS
AGAROSEGELEN
.
26
3.3.4.
VERDAU
DER
DNA
DURCH
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
26
3.4.
ARBEITEN
MIT
DEM
BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM
.
27
3
4
1.
AUFREINIGUNG
VON
REKOMBMANTEM
VIRUS
(PLAQUE-ASSAY)
.
27
3.4.2.
AMPLIFIKATION
VON
REKOMBMANTEM
VIRUS
.
27
3.4.3
TITERBESTIMMUNG
VON
REKOMBMANTEM
VIRUS
.
27
3.4
4.
LAGERUNG
VON
REKOMBMANTEM
VIRUS
.
28
3
4
5.
KONTAMINATION
VON
VIRUSUBERSTAENDEN
.
28
3.5.
ARBEITEN
MIT
PROTEINEN
.
28
3.5.1.
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
MITTELS
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
28
3.5.2.
WESTERNBLOT
.
29
3.5.3.
BESTIMMUNG
VON
PROTEMKONZENTRATIONEN
.
30
3.5.4.
HERSTELLUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER-SAEULEN
BZW
AFFIMTATSSAULEN
.
31
3.5.5.
EXPRESSION
VON
PROTEINEN
IM
BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM
.
31
INHALTSANGABE
III
3.5.6.
PROTEINAUFREINIGUNGEN
.
32
3.5.6.1.
HERSTELLUNG
VON
ROHEXTRAKTEN
.
32
3.5.6.1.1
.
ROHEXTRAKTE
AUS
INSEKTENZELLEN
.
32
3.5.6
1.2.
ROHEXTRAKTE
AUS
SAEUGERZELLEN
.
32
3.5.6.2.
AUFREINIGUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
.
33
3.5.6
3.
AUFREINIGUNG
VON
SUCI
.
33
3.5.6.4.
AUFREINIGUNG
VON
CYCLIN/CDK-KOMPLEXEN
.
35
3.5.6.5.
AUFREINIGUNG
VON
GROSSEM
SV40
T-ANTIGEN
.
35
3.5.6.6.
AUFREINIGUNG
VON
RP-A
.
36
3.5.6.7.
DNA
POLYMERASE
A-PRIMASE
AUS
293S-ZELLEXTRAKTEN
.
38
3.5.6.8.
REINIGUNG
REKOMBINANTER
DNA
POLYMERASE
A-PNMASE
AUS
INSEKTENZELLEN
.
40
3.5.6.9.
AUFREINIGUNG
VON
VORPHOSPHORYHERTER
DNA
POLYMERASE
A-PRIMASE
AUS
INSEKTENZELLEN
.
41
3.5.6
10.
LAGERUNG
VON
AUFGEREINIGTEN
PROTEINEN
UND
PROTEINKOMPLEXEN
.
42
3.6.
FUNKTIONELLE
ANALYSEN
DER
PROTEINKOMPLEXE
.
42
3.6.1.
HISTON-KINASE-ASSAY/POL-KINASE-ASSAY
.
42
3.6.2.
DNA-POLYMERASEAKTIVITAETSTEST
.
42
3.6.3.
PNMASEAKTIVITATSTESTS
.
43
3.6
3.1.
PNMASETEST
MIT
KLENOW-POLYMERASE
.
43
3.6.3.2.
PRIMASETEST
AUF
M13-DNA
.
44
3.6.4.
IN
VITRO
INITIATIONSREAKTIONEN
.
46
3.6
4
1
INITIATION
DER
SV40
DNA
REPLIKATION
.
46
3.64.2.
PRIMERSYNTHESE
AUF
M13-DNA
IN
ANWESENHEIT
VON
RP-A
UND
SV40
T-ANTIGEN.
.
47
3.6.4.3.
ANALYSE
DER
INITIATIONSPRODUKTE
DURCH
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
47
3.6.5
NUKLEASE-TEST
.
48
3.6.6.
CYCLIN/CDK
AKTIVITAET
IN
293S
ZELLEN
AN
VERSCHIEDENEN
STELLEN
DES
ZELLZYKLUS
.
48
3.6.7
KOIMMUNPRAZIPITATION
.
48
3.7.
PEPTIDKARTIERUNG
.
49
3.7.1
PHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
POLYMERASE
A-PRIMASE
IN
VITRO
.
49
3.7.2.
PHOSPHOAMTNOSAUREANALYSE
.
49
3
7.3.
TRYPTISCHE
PEPTIDKARTIERUNG
.
51
3
7
4.
IN
VIVO
PHOSPHOMARKIERUNG
VON
293S-ZELLEN
.
52
4.
ERGEBNISSE
.
53
4.1.
PHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
POLYMERASE
A-PRIMASE
IN
VITRO
DURCH
CYCLIN/CDK-KOMPLEXE
.
53
4.1.1
AUFREIMGUNG
VON
REKOMBINANTEN
CYCLIN/CDK-KOMPLEXEN.
53
4.1
1
1.
AUFREINIGUNG
VON
SUC
I
.
53
4.1.1.2.
AUFREIMGUNG
DER
KINASEKOMPLEXE
.
55
IV
INHALTSANGABE
4.1.1.3.
AKTIVITATSTEST
DER
CYCLIN/CDK-KOMPLEXE
.
57
4.1.2.
PHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
POLYMERASE
A-PRIMASE
MIT
CYCHN/CDK-KOMPLEXEN
.
59
4.1.2.1.
ALLGEMEINE
PHOSPHORYLIERUNGSUNTERSUCHUNGEN
.
59
4.1.2
2
KINETIK
DER
IN
VITRO
PHOSPHORYLIERUNG
.
60
4.1
3.
AUSWIRKUNG
DER
PHOSPHORYLIERUNG
AUF
DIE
ENZYMAKTIVITAETEN
VON
DNA
POLYMERASE
A-PNMASE
.
62
4.1.3.1.
POLYMERASEAKTIVITAT
IN
VITRO
PHOSPHORYLIERTER
DNA
POLYMERASE
A-PNMASE
.
62
4.1.3.2
PNMASEAKTIVITAET
AUF
POLY(DT)-MATRIZE
.
63
4.1.3.3.
PNMASEAKTIVITAT
AUF
M13
SSDNA
.
65
4.1
4
EINFLUSS
DER
PHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
POLYMERASE
A-PNMASE
AUF
DIE
INITIATION
DER
SV40
DNA
REPLIKATION
IN
VITRO
.
67
4.1.4.1.
DIE
REPHKATIONSPROTEINE
IM
SV40
SYSTEM
.
67
4.1.4.2.
INITIATION
DER
SV40
DNA
REPLIKATION
IN
VITRO
IN
ANWESENHEIT
VON
CYCHN/CDK-KOMPLEXEN.
.
68
4.1.4.3.
INITIATION
DER
SV40
REPLIKATION
MIT
VORPHOSPHORYLIERTER
DNA
POLYMERASE
A-PRIMASE
.
71
4.1.4.3
1.
AUFREINIGUNG
VORPHOSPHORYLIERTER
DNA
POLYMERASE
A-PNMASE
.
71
4.1
4.3.2.
KINASE
UND
NUKLEASETEST
AUFGEREINIGTER
VORPHOSPHORYLIERTER
DNA
POLYMERASE
A-PNMASE
.
73
4.1.4
3
3
INITIATION
DER
SV40
DNA
REPLIKATION
MIT
VORPHOSPHORYLIERTER
POLYMERASE
.
75
4.1
4.4.
BESTIMMUNG
DER
INITIATIONSAKTIVITAET
VON
DNA
POLYMERASE
A-PNMASE
IN
VITRO
.
77
4.1.4.5
PRIMERSYNTHESE
AUF
M13-DNA
IN
ANWESENHEIT
DER
REPHKATIONSPROTEINE
SV40
T-ANTIGEN
UND
RP-A
.
79
4.2.
ZELLZYKLUSABHAENGIGKEIT
DER
DNA
REPLIKATIONSAKTIVITAET
VON
DNA
POLYMERASE
A-PRIMASE
.
83
4.2.1.
SYNCHRONISIEREN
VON
293S
ZELLEN
IM
ZELLZYKLUS
.
83
4
2.2.
ZELLZYKLUSABHAENGIGKEIT
DER
AKTIVITAET
VON
CYCHN
ABHAENGIGEN
KINASEN
.
84
4.2.3.
AUFREINIGUNG
VON
DNA
POLYMERASE
A-PRIMASE
AUS
293S
ZELLEN
IN
VERSCHIEDENEN
ZELLZYKLUS-PHASEN.
86
4.2.4.
IN
VIVO
REPLIKATIONSAKTIVITAET
VON
DNA
POLYMERASE
A-PRIMASE
.
87
4.3.
VERGLEICH
DES
PHOSPHORYLIERUNGSMUSTERS
VON
DNA
POLYMERASE
A-PRIMASE
IN
VITRO
UND
IN
VIVO
DURCH
2D-PEPTIDKARTIERUNG.
89
4
3.1.
SYNCHRONISIEREN
VON
293S
ZELLEN
IN
SPAETER
S-PHASE
.
90
4.3.2.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
POLYMERASE
A-PRIMASE
IN
VITRO
UND
IN
VIVO
.
91
4.3.3.
PHOSPHOAMINOSAUREANALYSE
.
93
4.3.4
TRYPTISCHE
PEPTIDKARTIERUNG
.
96
4.3.4
1
ANALYSE
DER
PL80
UNTEREINHEIT
.
96
4.3
4
2
PEPUDKARTEN
VON
P68
NACH
PHOSPHORYLIERUNG
IN
VITRO
.
98
4
3
4
3
PEPTIDKARTE
EINER
4X
ALANIN
MUTANTE
VON
DNA
POLYMERASE
A-PNMASE
.
100
4
3.4.4
PEPTIDKARTE
VON
P68
NACH
PHOSPHORYLIERUNG
IN
VIVO
.
100
5.
DISKUSSION.
102
5.1.
UNTERSUCHUNG
VON
IN
VITRO
PHOSPHORYLIERTER
DNA
POLYMERASE
A-PRIMASE
.
102
INHALTSANGABE
V
5.2.
ZELLZYKLUSABHAENGIGE
REGULATION
VON
DNA
POLYMERASE
A-PRIMASE
.
106
5.3.
VERGLEICH
DER
IN
VITRO
UND
IN
VIVO
PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN
VON
DNA
POLYMERASE
A-PRIMASE
.
107
5.4.
MODELL
FUER
DIE
REGULATION
VON
DNA
POLYMERASE
A-PRIMASE
IM
ZELLZYKLUS
.
109
6.
ZUSAMMENFASSUNG.
115
7.
LITERATUR
.
116
8.
LISTE
DER
ABKUERZUNGEN.
135 |
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