FcgRlla-induzierte Signalvermittlungsprozesse in B-Zellen:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1
DIE
BEDEUTUNG
VON
ANTIGEN-REZEPTOREN
UND
FC-REZEPTOREN
IN
DER
1
IMMUNANTWORT
1.2
SIGNALVERMITTLUNG
UEBER
ITAM-TRAGENDE
MIRRS
4
A)
1.
SCHRITT:
AKTIVIERUNG
VON
PTK
8
B)
2.
SCHRITT:
REKRUTIERUNG
VON
ADAPTERPROTEINEN
UND
ENZYMEN
11
C)
3.
SCHRITT:
AKTIVIERUNG
VON
SIGNALKASKADEN
12
1.3
INHIBITION
UEBER
ITIM-TRAGENDE
REZEPTOREN
15
1.4
SIGNALVERMITTLUNG
UEBER
FCYRLLA/C
19
1.5
PROBLEMSTELLUNG
22
2.
ZUSAMMENFASSUNG
24
3.
MATERIAL
27
3.1
GERAETE
27
3.2
CHEMIKALIEN
28
3.3
ENZYME
28
3.4
PUFFER,
MEDIEN,
LOESUNGEN
28
3.5
ANTIKOERPER
30
3.6
OLIGONUKLEOTIDE
30
3.7
PLASMIDE
31
3.8
E.
COLI
BAKTERIENSTAEMME
32
3.9
ZELLINIE
32
3.10
SONSTIGE
MATERIALIEN
32
4.
METHODEN
34
4.1
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
34
4.1.1
ISOLIERUNG
VON
DNA
34
A)
ISOLIERUNG
VON
PLASMID
DNA
DURCH
CTAB
MINILYSE
34
B)
ISOLIERUNG
VON
PLASMID
DNA
IN
GROSSEN
MENGEN
34
4.1.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN
VON
NUKLEINSAEUREN
35
4.1.3
DNA
SEQUENZIERUNG
NACH
DER
DIDEOXY
METHODE
35
4.1.4
HYDROLYSE
VON
DNA
DURCH
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
36
4.1.5
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
37
4.1.6
HERSTELLUNG
CHEMISCH
KOMPETENTER
E.
COLI
37
4.1.7
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
38
4.1.8
TRANSFORMATION
CHEMISCH
KOMPETENTER
E.
COLI
38
4.1.9 TRANSFEKTION
VON
EUKARYONTENZELLEN
DURCH
ELEKTROPORATION
39
4.1.10PCR
39
4.2
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
40
4.2.1
ZAEHLEN
VON
ZELLEN
40
4.2.2
AUFTAUEN
UND
EINFRIEREN
VON
ZELLEN
40
4.2.3
ZELLKULTURBEDINGUNGEN
UND
MEDIENWECHSEL
40
4.2.4 ANREICHERUNG
FCYR-POSITIVER
ZELLEN
DURCH
YYPANNING
"
41
4.2.5
ANALYSE
DES
INTRAZELLULAEREN
KALZIUMFLUSSES
IN
IIA1.6-ZELLEN
41
4.3
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
42
4.3.1
PROTEINFAELLUNG
42
4.3.2
PROTEINBESTIMMUNG
43
A)
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
LOWRY
43
B)
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
43
4.3.3 SDS-GELELEKTROPHORESE
43
4.3.4
SILBERFAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
44
4.3.5
HERSTELLUNG
AGGREGIERTER
HLGG
45
4.3.6 AFFINITAETSREINIGUNG
VON
HIS
6
-FUSIONSPROTEINEN
AN
NICKEL-NTA
SEPHAROSE
AUS
E.
COLI
LYSATEN
45
4.3.7
KINASE-ASSAYS
46
A)
IN
VITRO
KINASE-ASSAY
REKOMBINANT
EXPRIMIERTER
CYTOPLASMATISCHER
FCYRLLA
DOMAENEN
MIT
REKOMBINANT
PRODUZIERTEN
PROTEIN
TYROSINKINASEN 46
B)
KINASE-ASSAY
AN
DURCH
IMMUNPRAEZIPITATION
ISOLIERTEM
FCYRLLA
(IMMUNKOMPLEX-KINASE-ASSAY)
46
4.4
IMMUNOCHEMISCHE
METHODEN
47
4.4.1
IMMUNPRAEZIPITATION
47
A)
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
FCYRLLA
ZUR
ANALYSE
VON
REZEPTOR
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
47
B)
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
PROTEIN-TYROSINKINASEN
48
C)
KOPRAEZIPITATION
VON
FCYRII
UND
PROTEIN-TYROSINKINASEN
48
D)
IDENTIFIZIERUNG
FCYRII-ASSOZIIERTER
PTK
DURCH
REPRAEZIPITATION
49
4.4.2
IMMUNBLOT
49
A)
PROTEINTRANSFER
49
B)
DETEKTION
VON
TYROSINPHOSPHORYLIERTEN
PROTEINEN
IM
IMMUNBLOT
50
C)
DETEKTION
VON
FCYRII
IM
IMMUNBLOT
50
D)
YYSTRIPPING
"
VON
IMMUNBLOTS
50
4.4.3 PEPTID-ELISA
50
4.4.4
ANALYSE
DER
OBERFLAECHENEXPRESSION
VON
FCYR
AUF
HA1.6-ZELLEN
MITTELS
DURCHFLUSSCYTOMETRIE
51
5.
ERGEBNISSE
52
5.1
TRANSFEKTION
DER
FCYR-NEGATIVEN
MAUS
B-ZELLINIE
IIA1.6
MIT
DEM
HUMANEN
FCYRLLA
WT
SOWIE
DELETIONS
UND
PUNKTMUTANTEN
DES
REZEPTORS
52
5.2
FCYRLLA
MODULIERT
KALZIUMSTROEME
IN
IIA1.6-ZELLEN
55
5.2.1
QUERVERNETZUNG
VON
FCYRLLA
INDUZIERT
INTRAZELLULAERE
KALZIUM
MOBILISIERUNG
55
5.2.2
DAS
ITAM
IN
DER
CYTOPLASMATISCHEN
DOMAENE
DES
FCYRLLA
IST
ESSENTIELL
FUER
DIE
FCYRLLA-VERMITTELTE
INTRAZELLULAERE
KALZIUMMOBILISIERUNG
56
5.2.3
FCYRLLA
INHIBIERT
DEN
BCR-INDUZIERTEN
KALZIUMEINSTROM
UEBER
DIE
PLASMAMEMBRAN
BEI
KO-QUERVERNETZUNG
MIT
DEM
BCR
58
5.2.4
DAS
ITAM
DES
FCYRLLA
IST
NICHT
AN
DER
INHIBITION
DES
BCR-INDUZIERTEN
KALZIUMSIGNALS
BETEILIGT
61
5.3
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
VON
FCYRLLA
IN
TRANSFIZIERTEN
IIA1.6-ZELLEN
63
5.3.1
FCYRLLA
WIRD
SOWOHL
NACH
ALLEINIGER
QUERVERNETZUNG
ALS
AUCH
NACH
KO-QUERVERNETZUNG
MIT
DEM
BCR
TYROSINPHOSPHORYLIERT
63
5.3.2
DAS
ITAM
IST
ESSENTIELL
FUER
DIE
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
VON
FCYRLLA
70
5.3.3
DER
C-TERMINALE
TYROSINREST
DES
ITAMS
(Y298)
IST
FUER
DIE
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
VON
FCYRLLA
NOTWENDIG
71
5.4
IIA1,6-ZELLEN
EXPRIMIEREN
DIE
PTK
LYN,
BLK,
SYK
UND
FYN
73
5.5
FCYRLLA-ASSOZIIERTE
PTK
IN
TRANSFIZIERTEN
IIA1,6-ZELLEN
75
5.5.1
PTK
BINDEN
AN
DAS
ITAM
DES
FCYRLLA
75
5.5.2
DIE
PTK
LYN
UND
FYN
BINDEN
AN
DAS
ITAM
DES
FCYRLLA
78
5.6
DIE
PTK
LYN,
BLK,
SYK
UND
FYN
ZEIGEN
UNTERSCHIEDLICHE
SUBSTRATSPEZIFITAETEN
BEZUEGLICH
DER
REKOMBINANT
EXPRIMIERTEN
CYTOPLASMATISCHEN
DOMAENEN
DER
FCYRLLA-MUTANTEN
81
6.
DISKUSSION
85
6.1
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DES
HUMANEN
FCYRLLA
IN
DER
MAUS
B-ZELLINIE
IIA1.6
85
6.2
INHIBITION
DES
BCR-INDUZIERTEN
KALZIUMEINSTROMS
DURCH
DEN
FCYRLLA
87
6.3
INTRAZELLULAERE
KALZIUMFREISETZUNG
NACH
FCYRLLA-QUERVERNETZUNG
93
6.4
REZEPTORPHOSPHORYLIERUNG
98
7.
LITERATURVERZEICHNIS
106
8.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
128
9.
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
133 |
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