Das kernkodierte ribosomale Chloroplastenprotein L11 in höheren Pflanzen: Genstruktur, Expression und phylogenetische Verwandtschaft mit dem homologen L11-Gen der Blaualge Synechocystis
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DAS KERNKODIERTE RIBOSOMALE CHLOROPLASTENPROTEIN L LL IN HOEHEREN
PFLANZEN: GENSTRUKTUR, EXPRESSION UND PHYLOGENETISCHE VERWANDTSCHAFT MIT
DEM HOMOLOGEN LLL-GEN DER BLAUALGE SYNECHOCYSTIS
INAUGURAL-DISSERTATION ZUR
ERLANGUNG DES DOKTORGRADES AM FACHBEREICH CHEMIE DER FREIEN UNIVERSITAET
BERLIN
VORGELEGT VON JUERGEN SCHMIDT-SOECHTIG AUS KASSEL
1996
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 ZIELSETZUNG 10
2. MATERIAL UND METHODEN 12
2.1 MATERIALIEN 12
2.2 MIKROBIOLOGISCHE-UND MOLEKULARGENETISCHE METHODEN 15
2.2.1 ANZUCHT UND LAGERUNG VON BAKTERIENKULTUREN 15
2.2.2 PRAEPARATION KOMPETENTER ESCHERICHIA CO/I-ZELLEN 15
2.2.3 ANZUCHT VON SYNECHOCYSTIS PCC6803 15
2.2.4 TRANSFORMATION VON E. COLI 16
2.2.5 AMPLIFIKATION UND PRAEPARATION VON X-PHAGEN 16
2.3 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 17
2.3.1 ALLGEMEINE BEDINGUNGEN FUER DIE ARBEIT MIT NUKLEINSAEUREN 17
2.3.2 REINIGUNG VON DESOXYOLIGONUKLEOTIDEN 17
2.3.3 DNA-PRAEPARATION AUS GRAM-NEGATIVEN BAKTERIEN 18
2.3.4 RNA-PRAEPARATION AUS SYNECHOCYSTIS 18
2.3.5 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN AUS HOEHEREN PFLANZEN 19
2.3.5.1 KULTIVIERUNG DER BLUETENPFLANZEN SPINACIA OLERACEA UND
ARABODOPSIS THALIANA 19 2.3.5.2 ISOLIERUNG HOCHMOLEKULARER DNA AUS S.
OLERACEA UND-A THALIANA 19 2.3.5.3 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS A.
THALIANA 20
2.3.6 PRAEPARATION VON X-DNA 20
2.3.7 PLASMID-DNA PRAEPARATION DURCH ALKALISCHE LYSE 21
2.3.8 TRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN IN HORIZONTALEN AGAROSEGELEN 22
2.3.9 TRENNUNG VON RNA-MOLEKUELEN IN AGAROSEGELEN 22
2.3.10 ELUTION VON DNA AUS AGAROSEGELEN 23
2.3.11 POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE ZUR TRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN 23
2.4 ENZYMATISCHE BEHANDLUNG VON DNA 24
2.4.1 DNA-HYDROLYSE DURCH RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 24
2.4.2 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN .:: 24
2.4.3 AUFMLLREAKTION 5-UEBERHAENGENDER ENDEN 25
2.4.4 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-ENDEN 25
2.4.5 RADIOAKTIVE 5-MARKIERUNG EINZELSTRAENGIGER DNA 25
2.4.6 RADIOAKTIVE MARKIERUNG DOPPELSTRAENGIGER DNA 26
2.4.7 PRIMER-EXTENSION 26
2.4.8 DNA-SEQUENZIERUNG 27
2.5 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 28
2.5.1 PCRVONXGTLL-CDNA 28
2.6 HYBRIDISIERUNG VON IMMOBILISIERTEN DNA-FRAGMENTEN 29
2.6.1 SOUTHERN-TRANSFER 29
2.6.2 NORTHERN-TRANSFER 29
2.6.3 PLAQUE-TRANSFER 29
2.6.4 HYBRIDISIERUNG MIT RADIOMARKIERTEN DESOXYOLIGONUKLEOTIDEN 30
2.6.5 HYBRIDISIERUNG MIT RADIOMARKIERTEN DNA-FRAGMENTEN 30
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
2.7 HETEROLOGE GENEXPRESSION IN. COLI. 31
2.7.1 HERSTELLUNG VON SYNECHOCYSTIS RP/72-AROC-GENKONSTRUKTEN UND
EXPRESSION IN E. COLI.... 31 2.7.2 KOMPLEMENTATION EINES
AROC-DEFIZIENTEN E. COFT-STAMMES 31
2.8 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 32
2.8.1 RIBOSOMENISOLATION AUS BAKTERIEN 32
2.8.2 PROTEINEXTRAKTION AUS RIBOSOMEN 32
2.8.3 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE(SDS-PAGE) 32
2.8.4 PRAEPARATIVE SDS-PAGE 33
2.8.5 2D-GELELEKROPHORESE 34
2.8.6 WESTERA-TRANSFER UND IMMUNOFAERBUNG 34
2.8.7 ENZYMATISCHE UND CNBR-SPALTUNG VON RIBOSOMALEN PROTEINEN 35
2.8.8 UMKEHRPHASEN- (REVERSED-PHASE-) HPLC 36
2.8.9 N-TERMINALE SEQUENZIERUNG 36
2.9 COMPUTERAUSWERTUNGEN 37
3. ERGEBNISSE 38
3.1 ISOLIERUNG UND NUKLEOTIDBESTIMMUNG VON LLL-CDNA-KLONEN
DER HOEHEREN PFLANZEN SPINACIA OLERACEA UND ARABIDOPSIS THALIANA 38
3.1.1 ISOLIERUNG VON L11 -CDNA-KLONEN AUS EINER SPINAT CDNA-BANK 38
3.1.2 CHARAKTERISIERUNG DES SPINAT LLL CDNA-KLONSPCLLL-2 40
3.1.3 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINES LLL-CDNASKLONS AUS EINER
A. THALIANA CDNA-BANK 45
3.2 IDENTIFIZIERUNG UND ISOLIERUNG DES SPINAT CHLOROPLASTENPROTEINS LLL
47
3.2.1 IMMUNDETEKTION EINES 17 KDA PROTEINS IN SPINAT
70S-PROTEINFRAKTIONEN 48
3.2.2 AUFREINIGUNG UND BESTIMMUNG DER N-TERMINALEN SEQUENZ 51 3.2.3
IDENTIFIZIERUNG EINES N-TERMINAL-BLOCKIERTEN 17 KDA-PROTEINS DURCH
N-TERMINALE SEQUENZIERUNG EINES INTERNEN PEPTIDS 54
3.2.4 POSITIONSBESTIMMUNG VON RPL11 IM 2D-PAGE VON SPINAT TP50 56 3.2.5
PRAEPARATIVE AUFREINIGUNG UND IDENTIFIZIERUNG VON MODIFIZIERTEN
AMINOSAEUREN IM CHLOROPLASTENLLL 57
3.2.5.1 ENZYMATISCHE UND CHEMISCHE SPALTUNG VON RPL11 ZUR GEWINNUNG VON
PEPTIDEN FUER DIE ANALYSE DES LYS-9 UND LYS-45 59
3.3 KLONIERUNG, SEQUENZIERUNG, EXPRESSION UND KOPIENZAHLBESTIMMUNG DES
CHLOROPLASTEN IPIII-GENS IM KERNGENOM DER HOEHEREN PFLANZE A THALIANA 63
3.3. 1 KLONIERUNG DES RPLU-GENS AUS EINER A. THALIANA A.-EMBL4 GENBANK
63
3.3.2 NUKLEOTIDSEQUENZ DES A. THALIANARPLL 1-GENS 63
3.3.3 IDENTIFIZIERUNG GENREGULIERENDER SEQUENZMOTIVE 69
3.3.4 IDENTIFIZIERUNG DER A. THALIANA LLL-MRNA 69
3.3.5 BESTIMMUNG DES TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTES DURCH PRIMER-EXTENSION
70
3.3.6 KOPIENZAHL DES RPLJJ-GENS IN A. THALIANA 72
IV
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
3.4 KLONIERUNG, ORGANISATION, UND EXPRESSION DES RPLLL-GENS IM
CYANOBAKTERIUM SYNECHOCYSTIS 74
3.4.1 KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DER RPLKA JZ-REGION VON SYNECHOCYSTIS
PCC6803 75
3.4.2 DAS SYNECHOCYSTIS RPLL 1 -GEN 76
3.4.3 DAS SYNECHOCYSTIS RPLL -GEN 80
3.4.4 IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES OROC-GENS IN DER 3
-REGION DES RPLKAJL-CXUSI&S 82
3.4.5 EXPRESSION DES SYNECHOCYSTIS AROC-GENS IN ESCHERICHIA COLI 84
3.4.6 KOMPLEMENTATION DER AROC-DEFIZIENTEN E. CO//-MUTANTE GLW-40 MIT
SYNECHOCYSTIS AROC-GENKONSTRUKTEN 87
3.4.7 KOPIENZAHL DER RPLKAJL-AROC-G&IE IN SYNECHOCYSTIS 88
3.4.8 TRANSKRIPTIONSANALYSE DER SYNECHOCYSTIS RPLKAJL-AROC-REGION 90
3.4.9 BESTIMMUNG DES 5-ENDES DER LL 1-MRNA DURCH PRIMER EXTENSION
ANALYSE... 92
3.4.10 DIE GENE IM 5 -FLANKIERENDENBEREICH 93
4. DISKUSSION 96
4.1 DAS KERNKODIERTE CHLOROPLASTEN LLL-GEN IN HOEHEREN PFLANZEN 96
4.1.1 DIE INTRON/EXON- STRUKTUR DES RPLU-GENS 96
4.1.2 DIE TRANSKRIPTIONALE REGULATION DES RPLJJ-GENS 101
4.1.3 DERKODON-GEBRAUCHIM^P/.//-GEN 104
4.1.4 DIEKOPIENZAHI ONRPLU IM GENOM VON^4. THALIANA 106
4.2 ORGANISATION UND TRANSKRIPTION DES CYANOBAKTERIELLEN RPLLL-GENS IM
RPLKAJL-AROC-GENDUSTER VON SYNECHOCYSTIS 107
4.2.1 DIE ORGANISATION DES CYANOBAKTERIELLEN RPLKAJL-AROC-C XSLTRS 107
4.2.2 TRANSKRIPTIONALE UND TRANSLATIONALE KONTROLLELEMENTE 112
4.2.3. DER KODON-GEBRAUCH DER SYNECHOCYSTIS RPLKAJL-GENE 116
4.3 DAS CYANOBAKTERIELLE UND PLASTIDAERE LLL-PROTEIN 119
4.3.1 PRIMAERSTRUKTUR- UND PROTEINCHEMISCHE VERGLEICHE MIT ANDEREN
EUBAKTERIELLEN, ARCHAEBAKTERIELLEN UND CYTOSOLISEHEN LLL -PROTEINEN 119
4.3.2 DIE METHYLIERUNG DES SPINAT RPL11 125
4.4 PHYLOGENETISCHE UNTERSUCHUNGEN UEBER DIE EVOLUTION DES LL 1-PROTEINS
128
5. ZUSAMMENFASSUNG 132
6. LITERATURVERZEICHNIS 134
7. ANHANG 147
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title_full_unstemmed | Das kernkodierte ribosomale Chloroplastenprotein L11 in höheren Pflanzen Genstruktur, Expression und phylogenetische Verwandtschaft mit dem homologen L11-Gen der Blaualge Synechocystis vorgelegt von Jürgen Schmidt-Söchtig |
title_short | Das kernkodierte ribosomale Chloroplastenprotein L11 in höheren Pflanzen |
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