Untersuchungen zur Interaktion des prokaryotischen Elongationsfaktors SELB mit RNA in vitro und in vivo:
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| Format: | Book |
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| Published: |
München
Diss.-Verl. NG-Kopierladen
1997
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| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Item Description: | Zugl.: München, Univ., Fak. für Chemie und Pharmazie, Diss., 1997 |
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
DIERNA-WELT
1
1.2
PROTEIN
-
RNA
WECHSELWIRKUNGEN
2
1.2.1
RNA-BINDENDE
PROTEINE
2
1.2.2
RNA
STRUKTUREN
3
1.3
SELEX
4
1.3.1
NICHT-PROTEIN-LIGANDEN
5
1.3.1.1
THEOPHYLLIN
5
1.3.1.2
BIOLOGISCHE
KOFAKTOREN
UND
RIBOZYME
6
1.3.1.3
ANTIBIOTIKA
6
1.3.1.4
AMINOSAEUREN
7
1.3.2
PROTEIN-LIGANDEN
8
1.3.2.1
WACHSTUMSFAKTOREN
8
1.3.2.2
RNA-BINDENDE
PROTEINE
8
1.3.2.2.1
DAS
REV
PROTEIN
9
1.3.2.2.2
PROTEINE
DER
TRANSLATIONSMASCHINERIE
9
1.4
DER
SPEZIELLE
ELONGATIONSFAKTOR
SELB
10
1.5
AUFGABENSTELLUNG
14
2
MATERIAL
16
2.1
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE
16
2.2
ENZYME
UND
PROTEINE
16
2.3
STANDARDS
UND
KITS
17
2.4
NUKLEOTIDE
UND
RIBONUKLEINSAEUREN
17
2.5
CHEMIKALIEN
UND
ANDERE
MATERIALIEN
17
2.6
GERAETE
19
2.7
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
20
3
METHODEN
21
3.1
BAKTERIENKULTUREN
21
3.1.1
PLATTENKULTUR
21
3.1.2
FLUESSIGKULTUR
21
3.1.3
GLYZERINKULTUR
21
3.2
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
22
3.2.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
22
3.2.2
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
(
HANAHAN,
1985)
22
3.2.3
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
ZELLEN
(DOWER
ET
AL.,
1988)
23
N
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.4
ELEKTROPORATION
(DOWER
ET
AL.,
1988)
23
3.2.5
BESTIMMUNG
DER
TRANSFONNATIONSEFFIZIENZ
24
3.3
ELEKTROPHORETISCHE
TRENNMETHODEN
24
3.3.1
NICHT-DENATURIERENDE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
24
3.3.2
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
24
3.3.3
DENATURIERENDE
HAMSTOFF-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
25
3.3.4
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
25
3.4
PRAEPARATION
UND
ANALYSE
VON
NUKLEINSAEUREN
26
3.4.1
PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION
26
3.4.2
ETHANOL-PRAEZIPITATION
26
3.4.3
QUANTITATIVE
DNA
UND
RNA-BESTIMMUNG
26
3.4.4
PRAEPARATION
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
27
3.5
PRAEPARATION
UND
ENZYMATISCHE
MODIFIKATION
VON
DNA
27
3.5.1
PLASMIDISOLIERUNG
OHNE
RNASE
27
3.5.2
PLASMIDISOLIERUNG
UEBER
QIAGEN-SAEUIEN
28
3.5.3
RESTRIKTION
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
28
3.5.4
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
28
3.5.5
DNA-SEQUENZIERUNG
29
3.5.6
REVERSE
TRANSKRIPTION
30
3.5.7
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR,
SAIKI
ET
AL.,
1988)
30
3.6
ENZYMATISCHE
MODIFIKATION
UND
SYNTHESE
VON
RNA
31
3.6.1
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
31
3.6.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
(CIP)
32
3.6.3
5
'
-ENDMARKIERUNG
VON
RNA
MIT
T4
POLYNUKLEOTIDKINASE
32
3.7
CHARAKTERISIERUNG
VON
PROTEINEN
33
3.7.1
SDS-GELELEKTROPHORESE
(LAEMMLI,
1970)
33
3.7.2
DETEKTION
DER
PROTEINBANDEN
33
3.7.2.1
FAERBUNG
MIT
COOMASSIE
BRILLIANT
BLAU
33
3.7.2.2
SILBERFAERBUNG
(MERRIL
ET
AL.,
1981)
33
3.8
IN
VITRO
ANALYSEN
DER
PROTEIN-RNA
WECHSELWIRKUNGEN
34
3.8.1
BINDUNGSASSAY
VON
RNA
UND
PROTEIN
34
3.8.1.1
PRAESELEKTION
34
3.8.1.2
DIE
SELEKTIONSREAKTION
34
3.8.1.3
DIE
BINDUNGSREAKTION
ZUR
ERSTELLUNG
VON
BINDUNGSKURVEN
34
3.8.2
SEPARATION
GEBUNDENER
RNA
UEBER
NITROZELLULOSE
35
3.8.2.1
FILTRATION
DER
BINDUNGSREAKTION
UEBER
NITROZELLULOSE
35
3.8.2.2
ELUTION
DER
RNA
VON
NITROZELLULOSEMEMBRANEN
35
3.8.3.
KOMPETITIONSEXPERIMENTE
35
3.8.4
RETENTION
VON
RNA-PROTEIN
KOMPLEXEN
IN
NATIVEN
GELEN
36
INHALTSVERZEICHNIS
M
3.9
IN
VIVO
ASSAY
ZUM
SELENOCYSTEINEINBAU
IN
E.
COLI
36
3.9.1
VORBEDINGUNGEN
FUER
DEN
IN
VIVO
ASSAY
36
3.9.2
MESSUNG
DER
DURCHLESERATE
DES
LACZ
GENS
(MILLER,
1972)
37
4
ERGEBNISSE
39
4.1
IN
VITRO
SELEKTION
VON
RNA
MOLEKUELEN
FUER
DIE
SPEZIFISCHE
ERKENNUNG
DES
PROKARYOTISCHEN
ELONGATIONSFAKTORS
SELB
39
4.1.1
BESCHREIBUNG
DER
VERWENDETEN
RNA
BIBLIOTHEKEN
39
4.1.2
DIE
SELEX
BEDINGUNGEN
41
4.1.3
DIE
SELEKTIERTEN
POOLS
BINDEN
AN
SELB
43
4.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
SELEKTIERTEN
RNA
SEQUENZEN
46
4.2.1
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DER
SELEKTIERTEN
POOLS
46
4.2.2
VERGLEICH
DER
ISOLIERTEN
SEQUENZEN
47
4.2.2.1
PRIMAERSEQUENZEN
VON
POOL
99
47
4.2.2.2
SEKUNDAERSTRUKTUREN
EINIGER
SELEKTIERTER
KLONE
VON
POOL
99
50
4.2.2.3
PRIMAERSTRUKTUREN
VON
POOL
40
52
4.2.2.4
SEKUNDAERSTRUKTUREN
EINIGER
SELEKTIERTER
KLONE
VON
POOL
40
53
4.3
IN
VITRO
ANALYSE
DER
SELEKTIERTEN
RNA
MOLEKUELE
(APTAMERE)
56
4.3.1
IN
VITRO
BINDUNGSASSAYS
VON
SELB
UND
SELEKTIERTEN
APTAMEREN
57
4.3.1.1
BINDUNG
DER
INDIVIDUELLEN
SEQUENZEN
AN
SELB
57
4.3.1.2
KOMPETITION
UM
SELB
BINDUNG
59
4.3.1.3
BESTIMMUNG
DER
DISSOZIATIONSKONSTANTEN
AUSGEWAEHLTER
APTAMERE
BEIDER
POOLS
62
4.3.1.4
UNTERSUCHUNG
DES
YYSUPERSCHIFTS
"
BEI
HOEHEREN
SELB
KONZENTRATIONEN
65
4.3.2
IN
VITRO
BINDUNGSASSAYS
VON
SELB-DERIVATEN
UND
SELEKTIERTEN
APTAMEREN
67
4.3.2.1
DERIVATE
DES
SELB
PROTEINS
67
4.3.2.2
BINDUNGSSTUDIEN
MIT
SELB
DERIVATEN
68
4.3.3
ZUSAMMENFASSUNG
DER
BINDUNGSAFFINITAETEN
DER
APTAMERE
FUER
SELB
UND
SEINE
DERIVATE
72
4.4
IN
VIVO
ANALYSE
DER
SELEKTIERTEN
APTAMERE
74
4.4.1
IN
VIVO
ASSAY
ZUR
MESSUNG
DES
EINBAUS
VON
SELENOCYSTEIN
IN
E.
COLI
74
4.4.1.1
DER
IN
VIVO
ASSAY
(MILLER,
1972)
75
4.4.1.2.
VEKTOR
UND
KONTROLLEN
DES
IN
VIVO
ASSAYS
76
4.4.1.3
DIE
APTAMER-KONSTRUKTE
77
4.4.1.4
DIE
EINGESETZTEN
BAKTERIENSTAEMME
79
4.4.2
EINIGE
SELEKTIERTE
APTAMERE
SIND
IN
VIVO
AKTIV
79
IV
INHALTSVERZEICHNIS
5
DISKUSSION
83
5.1
DIE
SELB-BINDENDEN
RNA
MOLEKUELE
83
5.1.1
VORBEMERKUNG
83
5.1.2
SEQUENZANALYSE
DER
SELEKTIERTEN
APTAMERE
84
5.2
DAS
IN
VITRO
BINDUNGSVERHALTEN
86
5.2.1
APTAMERE
MIT
UNTERSCHIEDLICHEN
SEQUENZEN
BINDEN
MIT
86
HOHER
AFFINITAET
AN
SELB
5.2.2
DIE
MEISTEN
APTAMERE
BINDEN
AN
DIE
C-TERMINALE
REGION
VON
SELB
88
5.3
IN
VIVO
SELENOCYSTEININKORPORATION
90
5.3.1
EINIGE
SELEKTIERTE
APTAMERE
SIND
IN
VIVO
AKTIV
90
5.3.2
DIE
MRNA
HAAMADELSTRUKTUR
HAT
UNTERSCHIEDLICHE
FUNKTIONEN
93
6
ZUSAMMENFASSUNG
95
7
*
LITERATURVERZEICHNIS
97
8
ANHANG
108
8.1
VERZEICHNIS
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
108
8.2
SEQUENZEN
DER
VERWENDETEN
OLIGONUKLEOTIDE
109
8.2.1
SELEKTIONSBIBLIOTHEKEN
UND
DAZUGEHOERIGE
PRIMER
109
8.2.2
WILDTYPSEQUENZ
UND
DAZUGEHOERIGE
PRIMER
110
8.2.3
KONSTRUKTE
FUER
DEN
IN
VIVO
ASSAY
UND
DAZUGEHOERIGE
PRIMER
110
8.2.4
SEQUENZIERPRIMER
111 |
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