PCR:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German English |
| Veröffentlicht: |
Heidelberg [u.a.]
Spektrum, Akad. Verl.
1997
|
| Ausgabe: | 2. Aufl. |
| Schriftenreihe: | Labor im Fokus
|
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|---|---|
| adam_text | Inhalt
Vorwort 11
Danksagung 13
Abkürzungen 14
Teil 1: Die wesentlichen Prinzipien und Methoden
1.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR)
19
1.1
Literatur
26
2.
Geräte, Reagentien und Hilfsmittel
27
2.1
Geräte
27
2.2
Wahl der Enzyme
30
2.2.1 ra#/Amplitaq®-DNA-Polymerase
32
2.2.2 Vent™-DNA-Polymerase
33
2.2.3 P/M-DNA-Polymerase
34
2.2.4 Ti/z-DNA-Polymerase
35
2.2.5 U1T™-DNA-Polymerase
35
2.2.6 /Vo-DNA-Polymerase
36
2.3
Weitere PCR-Reagentien
36
2.3.1 Desoxynucleosidtriphosphate
36
2.3.2 Puffer und MgCb
37
2.3.3 Hemmstoffe und Beschleuniger der PCR
38
2.3.4 DNA-Matrize
40
2.4
Primer
41
2.4.1 Konstruktion der Primer
41
2.4.2 Schmelztemperatur der Primer
42
2.4.3 Markierung der Primer
43
2.4.4 Berechnung der Primer-Konzentration
44
PCR
2.5 Hilfsmittel 45
2.6 Literatur 46
3. Vervielfältigung des richtigen Amplikons 47
3.1 Nachweis und Untersuchung von Amplikons 48
3.1.1 Gelelektrophorese 49
3.1.2 Nachweis von Amplikons in Echtzeit 51
3.1.3 Immunologischer Nachweis von PCR-Produkten 52
3.1.4
3.1.5 Nachweis durch Elektrochemoluminiszenz 54
3.2 Vermeiden von Verunreinigungen 54
3.2.1 Uracil-iV-GlykosylaseCUracil-DNA-Glykosylase) 57
3.2.2 UV-Strahlung 57
3.2.3 Behandlung mit Enzymen 58
3.2.4 Behandlung mit Psoralen und Isopsoralen 58
3.3 Spezifität der Reaktion 59
3.4 Heißstart
3.5 Heißstart-PCR mit Hilfe von Antikörpern 61
3.6 Touchdown-PCR 61
3.7 Verschachtelte PCR 62
3.8 PCR langer DNA-Fragmente 62
3.9 Die entscheidenden Parameter bei der PCR 63
3.10 Literatur 65
Teil 2: PCR-Techniken und Anwendungsmöglichkeiten
4. Klonierung und Modifizierung von PCR-Produkten 69
4.1 Klonierang von PCR-Produkten 70
4.1.1 Einführung von Restriktionsschnittstellen 70
4.1.2 Klonierung über glatte Enden 71
4.1.3
4.1.4 Bildung von Restriktionshälften 73
4.1.5 Klonieren ohne Ligation
4.1.6 UNG-Klonierang 75
4.1.7 pCR-ScriptTM-Klonierung 76
4.2 Modifikation von PCR-Produkten 77
4.2.1 Einbau von Promotoren und Ribosomenbindungs-
stellen 77
4.3 Verknüpfen überlappender PCR-Produkte 79
Inhalt
4.3.1 Bildung neuer Genkombinationen aus
genomischer DNA
79
4.3.2 Synthetische Gene
83
4.4
Literatur
84
5.
Isolierung und Konstruktion von DNA-Klonen
87
5.1
PCR von Genbanken
87
5.2
Verankerte PCR
88
5.2.1 RACE-PCR
88
5.2.2 Ligationsverankerte PCR
91
5.2.3 RNA-Ligase vermittelte
92
5.3
RNA-CRT-ļPCR
93
5.4
Herstellung von cDNA-Banken mit Hilfe der PCR
94
5.5
PCR mit degenerierten Primern
96
5.6
Differential display-PCR
97
5.7
Literatur
98
6.
PCR-Mutagenese
101
6.1
Deletion
101
6.2
В
104
6.3
Insertionsmutagenese
108
6.4
Literatur
109
7.
Sequenzierung von PCR-Produkten
111
7.1
Direkte Sequenzierung
113
7.2
Asymmetrische PCR
115
7.3
Sequenzierung einzelsträngiger DNA mit der
Exonuclease
117
7.4
Zyklische Sequenzierung
117
7.5
Direkte Sequenzierung an einer Festphase
119
7.6
Genamplifizierung mit anschließender Sequenzierung
der Transkripte (GAWTS)
120
7.7
Chemische Sequenzierung
122
7.8
PCR im Rahmen von archäologischen Untersuchungen
123
7.9
Literatur
125
8.
Charakterisierung unbekannter DNA-Bereiche
127
8.1
Vektoretten-PCR
127
8.2
Inverse PCR
130
8
8.3
Suche und Kartierang von Cosmiden, künstlichen
Hefe- (YACs), Pl- (PACs) und
Bakterienchromosomen (BACs) mit Hilfe der PCR
132
8.4
Zuordnung von Amplikons zu den Chromosomen
133
8.5
Alu-PCR
135
8.6
Tests an
136
8.7
Amplifizierung kleingeschnittener Chromosomen
137
8.8
Literatur
138
9.
Fingerprint-Analysen
141
9.1
Zufallig amplifizierte
141
9.2
Längenpolymorphismus von amplifizierten
Fragmenten (AFLPs)
143
9.3
Mikrosatelliten
145
9.4
VNTRs (variable
146
9.5
Typisierung von HLA-Antigenen der Klasse
147
9.6
Literatur
149
10.
Charakterisierung unbekannter Mutationen
151
10.1
Denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE)
151
10.1.1 Parallele DGGE
153
10.1.2 Senkrechte DGGE
154
10.2
Untersuchung von Polymorphismen im
Einzelstrang (SSCP)
156
10.3
Chemische Spaltung von Fehlpaarungen
158
10.4
Literatur
160
11.
Charakterisierung bekannter Mutationen
161
11.1
System der amplifizierungsresistenten Mutation (ARMS)
161
11.1.1 Grundprinzipien
161
11.1.2 Entwurf von Primern für das ARMS
163
11.2
Hybridisierung allelspezifischer Oligonucleotide an
fixierte PCR-Produkte im Dot-Blot
165
11.3
Umgekehrter Dot-Blot
166
11.4
RFLP-Analyse
167
11.5
Gendiagnostik mit
167
11.5.1 MuMplex-PCR-Analysen bei der
Duchenne-Muskeldystrophie
168
11.5.2 Mulüplex-ARMS bei Cystischer
169
11.6
Spezielle Methoden
170
Inhalt
11.6.1 Nachweis von Mutationen durch Einführen
einer Restriktionsschnittstelle 170
11.6.2 Amplifizierang mit
primernCCOP) 171
11.6.3 Mutationstest durch Primerverlängerung
(primer
11.6.4 Mutationsnachweis mit Hilfe der 5 —
nucleaseaktivität der
11.6.5 PCR-Amplifizierung vielfaltiger spezifischer
(PAMSA) 173
11.7 Nachweis vereinzelter entarteter Zellen im Anschluß
an eine Krebsbehandlung 174
11.8 Diagnostik bei der in v/iro-Befruchtung 175
11.9 Literatur 176
12. Nachweis von Krankheitserregern 179
12.1 Pilze 181
12.2 Viren 182
12.2.1 Menschliche
12.2.2 Andere klinisch relevante Viren 183
12.3 Bakterien 184
12.4 Untersuchungen an archivierten histologischen Präparaten 186
12.4.1 Mit Hämatoxylin oder Eosin gefärbte
Gewebeschnitte 186
12.4.2 Mit
Material 187
12.4.3 Zellabstriche 187
188
189
191
194
194
195
197
207
213
Index 215
12.5
In situ-PCR
12.6
Literatur
13.
. Quantitative PCR
13.1
DNA
13.2
RNA
13.3
Literatur
Anhang
A:
Glossar
B:
Produkte und Firmen
C:
Weiterführende Literatur
|
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