Der Interleukin-1 Rezeptorkomplex: Aufklärung des molekularen Aufbaus des Signaltransduktionskomplexes
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
VI
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
INTERLEUKIN-1
.
1
1.2.
DIE
IL-1
REZEPTOREN
UND
DIE
IL-1
SIGNALTRANSDUKTION
.
3
1.3.
FRAGESTELLUNG
.
11
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
13
2.1.
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
13
2.2.
GERAETE
.
17
2.3.
MATERIALIEN
.
17
2.2.2.
ANTIKOERPER
UND
REAGENZIEN
FILR
WESTERNBLOT
UND
FACS
.
17
2.2.3.
PLASMIDE
.
18
2.2.4.
SONSTIGE
MATERIALIEN,
REAGENZIEN
UND
KITS
.
18
2.3.
ZELLKULTUR
.
20
2.3.1.
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
.
20
2.3.2.
ZELLZAEHLUNG
UND
VITALITAETSBESTIINMUNG
.
21
2.4.
RNA
ISOLIERUNG
.
21
2.5.
REVERSE
TRANSKRIPTION
MIT
POLYMERASEKETTEIUEAKTION
(RT-PCR)
.
22
2.5.1.
REVERSE
TRANSKRIPTION
.
22
2.5.2.
POLYMERASEKETTENREAKTION
.
23
2.6.
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
(FACS)
.
24
2.6.1.
NACHWEIS
VON
IL-LREZEPTOREN
AUF
INTAKTEN
ZELLEN
.
25
2.6.2.
KOMPETITIONSSTUDIEN
.
25
2.7.
BINDUNGSSTUDIEN
MIT
[
125
I]IL-LA
.
26
2.7.1.
MARKIERUNG
VON
IL-LA
MIT
125
1
.
26
2.7.2.
BINDUNGSSTUDIEN
.
26
2.7.3.
SCATCHARDANALYSEN
.
27
2.7.4.
KOMPETITIONSSTUDIEN
.
27
2.8.
BIOSYNTHETISCHE
MARKIERUNG
MIT
35
S
.
27
2.9.
NACHWEIS
DER
IRAK-AKTIVIERUNG
.
28
2.9.1.
STIMULATION
UND
IMMUNPRAEZIPITATION
.
28
2.9.2.
IRAK
IN
VITRO
KINASEASSAY
.
29
2.10.
NACHWEIS
DER
JNK-AKTIVIERUNG
.
29
2.10.1.
STIMULATION
UND
PRAEPARATION
VON
ZELLLYSATEN
.
29
2.10.2.
JNK
IN
VITRO
KINASEASSAY
.
30
2.11.
GELRETARDATIONSANALYSEN
(EMSA)
.
30
2.11.1.
STIMULATION
UND
PRAEPARATION
VON
KEMEXTRAKTEN
.
30
2.11.2.
MARKIERUNG
VON
SONDEN
.
31
2.11.3.
EMSA
.
31
2.12.
PGE
2
ELISA
.
32
2.13.
PROLIFERATIONSSTUDIEN
UND
MTT-TEST
.
32
2.14.
TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE
.
33
2.14.1.
VERWENDETE
VEKTOREN
.
33
2.14.2.
VORGEHENSWEISE
.
34
2.14.3.
KONSTRUKTION
DES
LEERVEKTORS
PEF-BOS
.
35
2.14.4.
ELEKTROPORATION
.
35
2.14.5.
SELEKTION
VON
TRANSFEKTANTEN
.
36
2.15.
EXPRESSION
DER
EXTRAZELLULAEREN
DOMAENE
VON
IL-LRACP
.
36
2.15.1.
VERWENDETE
VEKTOREN
.
37
2.15.2.
PRAEPARATIVE
PCR
.
37
2.15.3.
KLONIERUNG
.
38
2.15.4.
EXPRESSION
.
40
2.15.4.1.
INDUKTION
.
40
2.15.4.2.
AUFREINIGUNG
DES
REKOMBINANTEN
PROTEINS
AUS
DEM
PERIPLASMA
.
40
2.15.4.3.
AUFREINIGUNG
DES
REKOMBINANTEN
PROTEINS
AUS
EINSCHLUSSKOERPEM
.
41
2.16.
WESTEMBLOT
.
42
2.16.1.
INKUBATION
MIT
DEM
NI-NTA
KONJUGAT
.
43
2.16.2.
INKUBATION
MIT
SERUMA
.
43
2.17.
SONSTIGE
METHODEN
.
44
2.17.1.
SDS-PAGE
.
44
2.17.2.
COOMASSIE
FAERBUNG
.
44
2.17.3.
LIGATION
.
44
2.17.4.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
45
2.17.5.
ERZEUGUNG
KOMPETENTER
E.
COLI
.
45
2.17.6.
PLASMIDGEWINNUNG
AUS
E.
COLI
.
45
2.17.7.
SEQUENZIERUNG
.
45
3.
ERGEBNISSE
.
47
3.1.
CHARAKTERISIERUNG
DES
MODELLSYSTEMS
.
47
3.1.1.
NACHWEIS
DER
OBERFLAECHENEXPRESSION
VON
IL
1
RI
(FACS)
.
47
3.1.2.
NACHWEIS
DER
BINDUNG
VON
IODIERTEM
IL-LA
.
48
3.1.3.
UNTERSUCHUNG
DER
IL-1
RESPONSIVITAET
.
48
3.1.4.
UNTERSUCHUNG
DER
IL-LRACP
EXPRESSION
.
49
3.2.
UNTERSUCHUNG
DES
SIGNALTRANSDUZIERENDEN
IL-1
RI
KOMPLEXES
.
50
3.2.1.
BIOSYNTHETISCHE
MARKIERUNG
MIT
35
S
.
50
3.2.2.
KOMPETITIONSSTUDIEN
(FACS)
.
51
3.2.3.
KOMPETITIONSSTUDIEN
([
125
I]IL-1
A)
.
53
3.3.
EXPRESSION
VON
IL-LRACP
MRNA
IN
UNTERSCHIEDLICHEN
ZELLTYPEN
.
54
3.4.
KORRELATION
VON
IL-LRACP
EXPRESSION
UND
IL-1
RESPONSIVITAET
.
56
3.5.
TRANSFEKTION
VON
EL-4
D6/76
MIT
MIL-LRACP
.
59
3.5.1.
OPTIMIERUNG
DER
SELEKTIONSBEDINGUNGEN
(TITRATION
VON
G418)
.
59
3.5.2.
OPTIMIERUNG
DER
ELEKTROPORATIONSBEDINGUNGEN
.
60
3.5.3.
TRANSFEKTION
VON
EL-4D6/76
MIT
PEF-ACPR
.
61
3.5.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
IL-LRACP
TRANSFEKTANTEN
.
63
3.5.2.1
.
EXPRESSION
VON
IL-LRACP
.
63
3.5.2.2.
IRAK
AKTIVIERUNG
.
64
3.5.2.3.
JNK
AKTIVIERUNG
.
64
3.5.2.4.
NF
K
B
UND
IL-1NF
AKTIVIERUNG
.
65
3.5.2.5.
IL-1
INDUZIERTE
IL-2
MRNA
SYNTHESE
.
67
3.5.2.6.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
CHARAKTERISIERUNG
DER
TRANSFEKTANTEN
.
67
3.6.
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEM
SIL-LRACP
UND
UEBERPRUEFUNG
DES
EINFLUSSES
AUF
DIE
IL-1
SIGNALTRANSDUKTION
.
68
3.6.1.
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSPLASMIDS
POPE-ACP
.
68
3.6.1.1.
OPTIMIERUNG
DER
PCR
ZUR
GENERIERUNG
DER
EXTRAZELLULAEREN
DOMAENE
DES
IL-LRACP
.
68
3.6.1.2.
KLONIERUNG
VON
POPE
AKI
.
69
3.6.I.2.
KLONIERUNG
VON
POPE
ACP
.
70
3.6.2.
OPTIMIERUNG
DER
INDUKTIONSBEDINGUNGEN
.
71
3.6.3.
AUFIEINIGUNG
DES
SIL-LRACP
AUS
PERIPLASMATISCHEN
EINSCHLUSSKOERPEM
.
72
3.6.3.1.
REINIGUNG
UEBER
NICKEL
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
72
3.OE.3.2.
RENATURIERUNG
DES
SIL-LRACP
.
73
3.6.3.3.
KONTROLLE
DES
SIL-LRACP
MIT
EINEM
NI-NTA
KONJUGAT
.
74
3.6.3.4.
NACHWEIS
DES
SERUM
A
EPITOPS
MIT
EINEM
ANTISERUM
.
75
3.6.4.
AUFIEINIGUNG
DES
SIL-LRACP
AUS
DEM
PERIPLASMA
.
75
3.6.4.I.
REINIGUNG
UEBER
NICKEL
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
75
3.OE.4.2.
KONTROLLE
DER
ELUIERTEN
FRAKTIONEN
MIT
EINEM
NI
NTA
KONJUGAT
.
77
3.6.4.3.
NACHWEIS
DES
SERUM
A
EPITOPS
MIT
EINEM
ANTISERUM
.
77
3.6.5.
EINFLUSS
DES
REKOMBINANTEN
SIL-LRACP
AUF
DIE
INK
AKTIVIERUNG
.
78
3.6.6.
EINFLUSS
DES
REKOMBINANTEN
SIL-LRACP
AUF
DIE
NF
K
B
AKTIVIERUNG
.
79
4.
DISKUSSION
.
81
4.1.
DAS
MODELLSYSTEM
.
81
4.2.
DER
IL-1
REZEPTOR
TYP
I
KOMPLEX
.
83
4.3.
DAS
IL-1
REZEPTOR
AKZESSORISCHE
PROTEIN
.
86
4.4.
DAS
LOESLICHE
IL-LRACP
.
91
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
99
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
101 |
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